高昆，劉紅霞，何朝勇,2

1中國藥科大學，南京210009；2天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室

血管成形術可重塑血管管腔、恢復受斑塊阻塞>血管內的血流通過、改善低灌注組織或器官內的氧氣物質供應，是臨床治療動粥斑塊積累的常規(guī)方法[1]。然而，由于手術導致的血管損傷或血流動力學改變會引起血管內膜增殖，導致血管二次狹窄，嚴重影響了血管成形術的治療效果和患者預后。研究數據顯示，冠脈植入裸露支架后1～3年內發(fā)生再狹窄的概率為30.6%。藥物洗脫支架盡管可降低再狹窄率，但這類藥物抑制了內皮細胞(ECs)的增殖和修復能力，導致術后晚期管腔丟失速度加快[2,3]。因此避免血管新生內膜形成所導致的血管二次狹窄，對提高血管介入療法的治療效果具有重要意義。目前對于新生內膜的形成機制尚不完全明確，通常認為該過程可分為以下三個階段：①多種因素引起血管血流動力學改變或血管內皮損傷，致使ECs維持的血管穩(wěn)態(tài)失衡；②免疫細胞和血小板浸潤到損傷部位并釋放IL-8、PDGF等細胞因子；③異常升高的細胞因子激活位于血管中膜的血管平滑肌細胞(VSMCs)，VSMCs在多種基質金屬蛋白酶(MMPs)的幫助下穿越內彈性膜到內膜下，大量增殖并分泌細胞外基質(ECM)，使得血管內膜增厚[4,5]。KLFs家族是體內廣泛分布的一類轉錄因子，在ECs、VSCMs、免疫細胞等部位中具有重要的生物調節(jié)功能，新生內膜形成過程中存在多種KLFs因子的表達變化。現就KLFs在血管內膜增生中的作用闡述如下。

1 KLFs的結構與功能

KLFs家族是一類結構高度保守的轉錄因子，因結構與轉錄因子SP1相似，故又被稱為SP/KLF家族。該家族每個成員的羧基端都有三個高度保守的Cys2 /His2鋅指結構域，每個鋅指結構都能與靶基因的啟動子或增強子上的5′-GACCC-3保守序列結合，調控相應基因的表達[6]。此外，有研究表明，KLFs的Cys2 /His2鋅指結構域還能與核輸入因子β或β樣核輸入因子結合調控KLFs由胞質向核內的轉位[7]。盡管KLFs家族成員在結構上高度保守，所識別的DNA序列亦存在一定程度重疊，但不同的KLFs對同一基因卻擁有不同的轉錄調控作用。這主要是由于某些KLFs蛋白的氨基端具有轉錄激活區(qū)域和轉錄抑制區(qū)域，能與轉錄輔激活物、轉錄輔阻遏物相結合調控KLFs的轉錄活性，如KLF3、KLF8、KLF12的氨基端存在CtBP蛋白結合位點，KLF10、KLF11等的氨基端具有Sin3蛋白結合位點，這些位點能與轉錄輔阻遏物CtBP或者Sin3蛋白結合，使KLFs由轉錄激活因子轉變成抑制因子。這種調控方式使得不同KLFs之間存在相互調節(jié)、競爭、協同的作用，KLFs在細胞內的生物學功能也因此變得更加多樣和復雜。

2 KLFs對血管內皮功能的調節(jié)

ECs是構成血管內膜的重要成分，在正常生理狀態(tài)下，分泌NO及多種細胞因子調控血管張力、血管生長和凝血等生理功能。當血流狀態(tài)改變或外力引起內皮損傷后，ECs對中膜VSMCs的保護和調控遭到破壞，導致VSMCs暴露于炎癥因子和生長因子，引起VSMCs過度增殖和遷移形成新生內膜。部分在內皮細胞中高表達的KLFs如KLF2、KLF4、KLF6和KLF11可通過調節(jié)ECs中eNOS、IL-6、黏附分子的表達等途徑參與調節(jié)血管內膜穩(wěn)態(tài)[8,9]，并借此參與新生內膜的形成過程。

2.1 KLF2和KLF4與血流動力學變化 ECs是血管中直接與流動的血液相接觸的細胞，其細胞膜上的機械力感受器能夠感知血流變化，并通過復雜的機械力信號傳導通路將機械信號傳遞到核內，調節(jié)ECs內的氧化應激、細胞排列、脂蛋白滲透與氧化等過程。通常認為高剪切力的單向層流(UF)具有保護ECs的作用，而低剪切力的湍流(DF)則會誘導ECs表達VCAM-1、E-selectin、MCP-1招募免疫細胞或釋放炎癥因子IL-6等激活中膜VSMCs。研究發(fā)現，當某些外界因素引起血流由UF變?yōu)榈图羟辛ν牧鱀F時，ECs中的一些機械力敏感型轉錄因子如KLF2、KLF4會出現明顯的表達降低。研究發(fā)現，KLF2能調控血流動力敏感蛋白PPAP2B的表達，介導層流下ECs的排列和抗炎作用[10]。CD39是ECs膜上一種具有動脈粥樣硬化(AS)保護作用的蛋白，層流誘導的KLF2能在轉錄水平與CD39基因的啟動子結合增加CD39表達，減少ApoE-/-小鼠的AS斑塊形成[8]。此外，轉錄組學研究顯示，在內皮細胞中敲除KLF2和KLF4會損傷ECs內氧化應激、炎癥反應、凝血等過程[9]。上述結果提示，在血管靜脈瘺、靜脈旁路移植手術等引起血流狀態(tài)變化時，KLFs可能通過參與調節(jié)ECs對血流狀態(tài)變化的應答參與新生內膜形成。

2.2 KLF6與血管內皮損傷修復 KLFs抑制內皮細胞損傷后的修復亦可能是其參與調節(jié)新生內膜的形成的方式之一。研究發(fā)現，轉錄因子KLF6能與MMP14的啟動子結合，在轉錄水平增加MMP14的表達，而MMP14會通過水解內皮糖蛋白釋放可溶性內皮糖蛋白影響TGF-β信號通路，從而影響血管損傷后內皮細胞修復[11]。另外，有研究發(fā)現KLF6還可與SP1、Smad3組成三元復合物，該復合物能與Ⅰ型TGF-β受體ALK-1的啟動子結合促進ALK-1的表達，從而影響TGF-β信號通路，間接參與TGF-β信號通路介導的ECs損傷后修復過程[12]。

3 KLFs 對炎癥反應的調控

內皮損傷后，ECs招募白細胞在損傷局部浸潤，并釋放炎癥因子是引起VSMCs激活的重要原因之一。KLFs能通過多種途徑參與對ECs內炎癥反應及免疫細胞招募的調控。在ECs中過表達轉錄因子家族中的KLF2和KLF4能促進ECs中eNOS和血栓調節(jié)素的表達，使ECs呈現出一種抗炎表型[8]。Yoshida等[13]發(fā)現，應用Tie-Cre在內皮細胞和造血細胞中特異性敲除KLF4能加重血管損傷后新生內膜形成。KLF4能通過抑制NF-κB與黏附分子VCAM-1啟動子的結合，減少ECs表達VCAM-1，從而抑制血管損傷后的免疫細胞浸潤。KLF2亦會以類似的方式抑制ECs細胞膜表面VCAM-1、E-selectin的表達，影響ECs招募中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞。此外，KLF11似乎能以負反饋的方式調節(jié)ECs炎癥反應，用炎癥因子TNF-α和LPS刺激ECs炎誘發(fā)炎癥的同時也會增加ECs中KLF11的表達；而KLF11-/-小鼠表現出增強內皮細胞對白細胞的招募，誘發(fā)內皮炎癥變化[14]。除直接調控ECs的炎癥反應，KLFs也可能會通過調節(jié)單核細胞分化減輕血管損傷后的局部炎癥反應。有報道發(fā)現，KLF4能促進巨噬細胞由M1型向M2型轉化，在髓系細胞中敲除KLF4顯示出加重AS斑塊中的炎癥反應[15]。

4 KLFs對VSMCs功能的調控

VSMCs是構成動脈血管中膜的主要細胞成分，通過調整自身的收縮與擴張控制著動脈的管徑、血壓、血流等特性。生理狀態(tài)下的VSMCs表現出很低的增殖和遷移能力，分泌較少的ECM，在轉錄因子SRF和輔助轉錄因子myocardin的調控下表達與VSMCs收縮功能相關的蛋白，如SM-MHC、α-actin、Sm22α等[5]，這種狀態(tài)下的VSMCs被稱為收縮型VSMCs。當血管損傷或疾病使VSMCs暴露于Ox-LDL、炎癥因子、生長因子等刺激下，其會通過表型轉換成為具有更高增殖和遷移能力和分泌大量ECM的合成表型細胞，同時減少表達收縮功能蛋白[16]。這種代謝旺盛的合成表型VSMCs是構建新生內膜的關鍵，因此調控血管損傷后VSMCs的異?；顒訉π律鷥饶ば纬删哂兄匾饬x。

4.1 KLFs與VSMCs表型轉換 KLF4通常主要表達在胃腸上皮組織中，在完整血管的VSMCs中表達量很低，但在血管受到損傷后的短期內，VSMCs內KLF4的mRNA和蛋白水平能快速升高。PDGF是一種經典的誘導VSMCs增殖、減少收縮marker基因表達的生長因子。Liu等[17]發(fā)現，VSMCs中KLF4的mRNA會在PDGF作用45 min后達到最高值，用siRNA沉默KLF4能部分抑制PDGF誘導的VSMCs收縮Marker基因表達。Laura等[18]用譜系追蹤技術分析AS斑塊中平滑肌細胞樣細胞(SLC)的來源，結果顯示VSMCs中特異性敲除KLF4能抑制VSMCs表型轉換并提升AS斑塊及纖維帽中SLC的含量。研究顯示，KLF4能通過多種途徑參與調控VSMCs表型轉換過程。一方面KLF4能直接與SM-MHC、α-actin、Sm22α等VSMCs收縮表型的Marker基因啟動子區(qū)域的G/C抑制元件結合，抑制VSMCs收縮功能相關基因的表達。另一方面，KLF4能通過抑制SRF與SM-MHC、α-actin、Sm22α等基因啟動子區(qū)域的CArG元件結合，或抑制輔助轉錄因子myocardin的表達，間接性地調控VSMCs收縮型的marker基因[19]。KLF4還是骨形成蛋白-2,-4,-6和TGF-β1的下游分子，后者通過誘導miRNA-143/145表達減少KLF4的mRNA水平，維持VSMCs的收縮表型[20]。此外，與KLF4的作用相似，VSMCs中KLF5和KLF15的含量也在血管損傷后增加，主要表現出促VSMCs增殖和表型轉換作用。KLF5和KLF8能通過抑制α-SMA和Sm22α的啟動子活性，間接性地阻斷血管緊張素Ⅱ引起的VSMCs收縮[21]。

4.2 KLFs與VSMCs增殖 KLF4是抑制細胞周期進程的重要轉錄因子，在腸道黏膜組織中或細胞受到輻射損傷后，KLF4能促進細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p53與p21的啟動子結合，通過提高p21的表達阻斷細胞周期進程，抑制細胞增殖。Yoshida等[22]發(fā)現，在VSMCs中KLF4亦通過相似的方式抑制內皮損傷后VSMCs增殖，加重血管損傷后新生內膜的形成。此外，有研究提出KLF4誘導p21表達的作用能被小泛素化修飾逆轉。用PDGF在誘導VSMCs表型轉換和KLF4表達的同時，還能促進KLF4與小泛素化修飾中的關鍵酶Ubc9結合，促進KLF4的小泛素化修飾過程。小泛素化KLF4招募部分輔阻遏物如NCoR和HDAC2到p21的啟動子，抑制p21的轉錄，表現出促進VSMCs增殖的作用[23]。與KL4相似，KLF5亦主要以p21依賴的方式參與調控VSMCs增殖。KLF5可以通過抑制p21的表達阻斷血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導的細胞周期進程。另外，Ang Ⅱ可通過ERK-MAPK通路激活KLF5的表達，同時促進KLF5與c-Jun結合增加細胞周期蛋白Cyclin D1的表達，最終引起VSMCs的增殖。在非VSMCs細胞中，亦有研究發(fā)現KLF6、KLF8能與Cyclin D1的啟動子結合促進細胞周期。這些KLFs可能以相同方式調控VSMCs的增殖，參與新生內膜的形成，不過此有待在動物體內和VSMCs上進行驗證。

5 未來研究展望

目前,針對血管內膜增生尚無有效的預防和治療辦法，在臨床中常采用藥物洗脫支架緩解血管植入支架后的二次狹窄，但仍不能完全解決這一問題。有報道發(fā)現miRNA家族多個成員如miRNA143/145能通過抑制KLF4的表達抑制新生內膜，同時部分小分子化合物如ATRA能抑制KLF4在Sm22α啟動子上的結合抑制VSMCs表型轉換和增殖。這些研究均提示以KLFs為靶點治療新生內膜的潛在可行性。然而，KLFs家族成員在在不同組織和細胞中表達的種類和功能都不盡相同，在新生內膜形成過程中，同一KLF在ECs和VSMCs中可能發(fā)揮完全相反的效果，如KLF4能維持ECs的抗炎表型，而在血管損傷后的VSMCs中促進VSMCs表型轉換。在開發(fā)以單個KLFs為治療新生內膜的靶點時，應該注意KLFs生物學功能的組織特異性。此外，當前對KLFs家族在新生內膜中的生物功能還缺乏系統性地認識，除本文涉及的主要幾種KLFs外，KLFs家族其他成員在內膜增生中的作用還尚不明確，有報道發(fā)現不同KLFs之間存在相互競爭或協同作用，此可能會削弱以單個KLF為治療靶點的治療效果。KLFs家族在新生內膜中的作用還需進一步研究和揭示，這將更有助于開發(fā)以KLFs或KLFs相關信號通路為靶點的治療策略。