劉博文，潘麗慧，曹旭晨

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤一科,國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300060

乳腺癌是全世界女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，術(shù)后出現(xiàn)的治療抵抗、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是我們面臨的主要挑戰(zhàn)[1]，因此深入了解其調(diào)控機(jī)制有重要意義。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性、高度保守的短鏈非編碼RNA，其對(duì)基因表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，部分miRNA還可作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/Smad信號(hào)通路的下游信號(hào)分子發(fā)揮作用。上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移，在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用，但該過(guò)程受TGF-β/Smad信號(hào)通路所調(diào)控。此外，有研究表明miRNA、TGF-β相關(guān)信號(hào)通路及EMT過(guò)程在乳腺癌細(xì)胞的干性調(diào)控中亦發(fā)揮重要作用[2,3]?，F(xiàn)對(duì)miRNA、TGF-β信號(hào)通路及EMT過(guò)程在乳腺癌細(xì)胞及其干性、腫瘤微環(huán)境中的相互調(diào)控作用綜述如下。

1 miRNA 對(duì)乳腺癌的調(diào)控作用

miRNA是小的非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)為19～25個(gè)核苷酸，最新的miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)已注冊(cè)了1193個(gè)小鼠miRNA基因和1881個(gè)人類(lèi)的miRNA基因。經(jīng)嚴(yán)格篩選，小鼠和人體內(nèi)確定的標(biāo)準(zhǔn)miRNA基因數(shù)量分別為475和519。miRNA對(duì)其靶mRNA的識(shí)別主要通過(guò)miRNA與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的互補(bǔ)序列結(jié)合來(lái)介導(dǎo)。有研究表明，miRNA可在組織發(fā)育中呈差異性和暫時(shí)性表達(dá)[4]。在腫瘤學(xué)研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，不同的miRNA特征可準(zhǔn)確分辨腫瘤和腫瘤的不同亞型[5]。此外，miRNAs還可作為腫瘤診斷和治療的候選標(biāo)志物，耿淼等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低表達(dá) Let-7g 的三陰性乳腺癌(TNBC)患者預(yù)后更差，提示Let-7g可作為T(mén)NBC患者治療和預(yù)后評(píng)價(jià)潛在的分子靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，諸多miRNA可抑制不同的腫瘤相關(guān)基因，即扮演癌基因和抑癌基因的角色[7]。如miRNA-29在乳腺癌中因可通過(guò)抑制抑癌基因DNA甲基化，被證明是一種抑癌因子，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖減少和藥物敏感性增加[8]。而Liu等[9]證明，miRNA-29b的表達(dá)促進(jìn)了人乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，miRNA-29b基因具有靶向腫瘤抑制因子 PTEN的能力。換言之，miRNA-29在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中既是抑癌因子亦是促癌因子。

2 TGF-β信號(hào)通路對(duì)乳腺癌的調(diào)控作用

TGF-β家族由三種TGF-β亞型、激活素、抑制素、骨形成蛋白(BMPs)、生長(zhǎng)和分化因子組成。大致可分為T(mén)GF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS兩個(gè)亞家族。具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附、凋亡、胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等重要作用[10]。TGF-β家族的配體與兩種絲氨酸—蘇氨酸激酶受體(Ⅱ型和Ⅰ型受體:TβR-Ⅱ和TβR-Ⅰ)結(jié)合后，特異性復(fù)合物被激活以傳導(dǎo)下游信號(hào)。TGF-β可激活Smad依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中TGF-β亞型和激活素可觸發(fā)Smad2和Smad3的磷酸化(激活素/TGF-β特異性R-Smads)。BMP可觸發(fā)Smad1、Smad5和Smad8的磷酸化(BMP特異性R-Smads)。此外TGF-β還可激活幾種Smad非依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK通路等非Smad信號(hào)通路。TGF-β在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用主要體現(xiàn)在以下方面[11]：①生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，特別是在腫瘤發(fā)生的早期階段擺脫TGF-β的生長(zhǎng)抑制；②在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)TGF-β增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和纖維化；③通過(guò)TGF-β促進(jìn)EMT和(或)轉(zhuǎn)移；④腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。TGF-β在乳腺癌中扮演雙重角色，其不僅是一種抑癌因子，還可促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。TGF-β2失活提高了癌前病變或分化較高的乳腺癌細(xì)胞侵襲力，但亦下調(diào)了分化較差?lèi)盒猿潭容^高的乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[12]。

3 EMT過(guò)程對(duì)乳腺癌的調(diào)控作用

腫瘤細(xì)胞的EMT是指由極化的穩(wěn)定的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的間充質(zhì)細(xì)胞，從而使其侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。這種轉(zhuǎn)化的特征是降低促進(jìn)細(xì)胞之間接觸蛋白質(zhì)(如E-鈣黏蛋白和γ-連環(huán)蛋白)的表達(dá)，增強(qiáng)間充質(zhì)標(biāo)志物(如波形蛋白，N-鈣黏蛋白和纖維粘連蛋白)的表達(dá)，同時(shí)亦可增強(qiáng)部分基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。EMT可分為發(fā)育型(Ⅰ型)、纖維化和傷口愈合型(Ⅱ型)和腫瘤型(Ⅲ型)。最新研究表明，EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，EMT能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞可脫離原發(fā)腫瘤，穿過(guò)基底膜進(jìn)入循環(huán)外周血，然后再逆轉(zhuǎn)為上皮表型并形成腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶[13]。既往研究不斷肯定腫瘤微環(huán)境(TME)在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞EMT中的重要性，如缺氧、細(xì)胞外基質(zhì)組成的改變及其生物學(xué)特性亦決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β的反應(yīng)及其驅(qū)動(dòng)EMT過(guò)程和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的能力[14]。有研究表明，EMT相關(guān)基因的表達(dá)與基底樣型乳腺癌相關(guān)，包括轉(zhuǎn)錄因子FOXC2等?；讟有腿橄侔┻h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、預(yù)后差，高表達(dá)EMT相關(guān)蛋白(波形蛋白、僅平滑肌肌動(dòng)蛋白、N-鈣黏蛋白、鈣黏蛋白-1 )、層黏連蛋白、肌成束蛋白，低表達(dá)E-鈣黏蛋白[15]。

4 乳腺癌中miRNA、TGF-β信號(hào)通路及EMT過(guò)程的相互調(diào)節(jié)機(jī)制

有研究證實(shí)，miRNA可通過(guò)靶向TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游靶點(diǎn)，在多個(gè)水平調(diào)控TGF-β信號(hào)[16]。目前在腫瘤中已發(fā)現(xiàn)了多種靶向TGF-β受體的miRNA，包括miR-21、miR-17/92、miR-106b、miR-211及miR-590等[17]。反過(guò)來(lái)，TGF-β/BMP信號(hào)傳導(dǎo)通路可調(diào)控多種miRNA，從而形成反饋調(diào)節(jié)。如TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑可上調(diào)miR-21、miR-181、miR-10b、miR-17/92、miR-155、miR-192、mir-23/24/27、miR-216/217、miR-494和miR-182的表達(dá)[16]；下調(diào)miR-200、miR-203、let-7、miR-34a和miR-584的表達(dá)[18]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，部分miRNAs可直接靶向EMT轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控EMT。如miR-205和miR-200協(xié)同作用可通過(guò)抑制ZEB從而抑制EMT[19]。有部分miRNA通過(guò)靶向細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分調(diào)節(jié)EMT。CDH1是調(diào)節(jié)腫瘤上皮細(xì)胞之間黏附、運(yùn)動(dòng)的鈣依賴(lài)蛋白，在人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞中，miR-194的過(guò)表達(dá)可直接抑制CDH1從而抑制EMT過(guò)程。

TGF-β、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、NF-κB、Wnt、Notch和hedgehog蛋白等信號(hào)通路及重要因子可直接或間接促進(jìn)Snail、ZEB1/2和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞上皮表型的基因表達(dá)，促進(jìn)EMT，我們將這些轉(zhuǎn)錄因子稱(chēng)為“EMT的激活劑”[20]。如TGF-β與其受體(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ)相結(jié)合后會(huì)使Smad 2和Smad3磷酸化，并與Smad4形成復(fù)合體，之后該復(fù)合體轉(zhuǎn)入核內(nèi)，在核內(nèi)進(jìn)一步調(diào)控TGF-β靶基因及其他DNA結(jié)合因子的表達(dá)，如Snail、ZEB和 Twist基因等,結(jié)果造成上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)及間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)[21]。Zhang等[22]在前期研究中發(fā)現(xiàn),FAM64A可促進(jìn)乳腺癌的EMT過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲及運(yùn)動(dòng)，同時(shí)在乳腺癌細(xì)胞干性的維持中也發(fā)揮著重要作用，但FAM64A對(duì)EMT的具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步研究。TGF-β誘導(dǎo)EMT的具體過(guò)程可分為兩步，第一步，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為部分EMT狀態(tài)，同時(shí)SNAIL-miR-34雙穩(wěn)態(tài)開(kāi)關(guān)被激活，這導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低和波形蛋白的表達(dá)增加。第二步，細(xì)胞從部分EMT狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)狀態(tài)，并且ZEB1-miR-200雙穩(wěn)態(tài)開(kāi)關(guān)被激活，這導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低和波形蛋白的表達(dá)增加[23]。

5 miRNA、TGF-β信號(hào)通路及EMT過(guò)程在乳腺癌微環(huán)境調(diào)節(jié)中的作用

miRNA不僅可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的特性，還可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、治療抵抗及免疫抑制[24]。癌細(xì)胞中miRNAs改變可通過(guò)改變癌細(xì)胞分泌的因子產(chǎn)生對(duì)癌細(xì)胞有利的微環(huán)境，TGF-β能上調(diào)miR-21和miR-155來(lái)促進(jìn)MDSCs的產(chǎn)生[25]。有學(xué)者提出TGF-β相關(guān)的miRNAs可調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的形成， TGF-β誘導(dǎo)型miR-21可靶向Smad7并潛在促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤形成[26]。TGF-β通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞的活性而抑制腫瘤細(xì)胞的活性，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中TGF-β信號(hào)通路的喪失能夠促使驅(qū)動(dòng)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的微環(huán)境因子的產(chǎn)生。在乳腺成纖維細(xì)胞中選擇性刪除TβR-Ⅱ基因表達(dá)后也可觀察到乳腺癌形成，其機(jī)制是通過(guò)增加成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(如TGF-β、MSP和HGF)來(lái)改變細(xì)胞外基質(zhì)的生物學(xué)特點(diǎn)，從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

整合素是有致癌效應(yīng)的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的突出介質(zhì)及并且其與EMT密切相關(guān)。整合素是將細(xì)胞外基質(zhì)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架系統(tǒng)連接起來(lái)的跨膜支架，它們還可作為機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。其中，整合素對(duì)TGF-β反應(yīng)性的表達(dá)上調(diào)對(duì)于EMT至關(guān)重要。整聯(lián)蛋白通過(guò)FAK橋接與TβR-Ⅱ形成復(fù)合物，導(dǎo)致Src介導(dǎo)的Tyr284的TβR-Ⅱ磷酸化，后者可募集將TGF-β與p38MAPK的擴(kuò)增活化相耦合所必需的ShcA和Grb2[27]。抑制這些關(guān)鍵因子可抑制致癌的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，包括其與NF-κB、Cox-2和PGE2信號(hào)途徑的偶聯(lián)，以及阻止TGF-β驅(qū)動(dòng)的EMT和轉(zhuǎn)移表型的獲得。TGF-β信號(hào)通路還受其與整合素的物理相互作用的影響，整合素亦可調(diào)節(jié)EMT過(guò)程及p38 MAPK信號(hào)通路中的TGF-β的激活。最近，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者將EMT中的TGF-β刺激與播散性乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相聯(lián)系，改變TGF-β激活Smad4的復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，從而阻斷Pyk2(可介導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性休眠的逃逸)的表達(dá)[28]。但這些受E-cadherin和整合素的“倒數(shù)式”表達(dá)模式的控制，休眠細(xì)胞通常是E-鈣黏蛋白高表達(dá)，整合素低表達(dá)，而成熟細(xì)胞通常是整合素高表達(dá)，E-鈣黏蛋白低表達(dá)[29]。更為重要的是，EMT表型的獲得代表了分子開(kāi)關(guān)允許細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性休眠和生長(zhǎng)之間切換，這是由于E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，其以異型方式與整聯(lián)蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相互作用，導(dǎo)致整合素和Pyk2介導(dǎo)轉(zhuǎn)移失活。最后，我們將“整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)換”定義為T(mén)GF-β致癌活性的新型調(diào)節(jié)劑。

6 miRNA、TGF-β信號(hào)通路及EMT過(guò)程在乳腺癌干細(xì)胞(CSCs)調(diào)控中的作用

CSCs是指像干細(xì)胞一樣有自我更新分化能力的腫瘤細(xì)胞。但它們是否能分化成不同類(lèi)型的細(xì)胞還存在爭(zhēng)議。程騰等[30]通過(guò)構(gòu)建乳腺癌干細(xì)胞裸鼠移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，miR-429可降低乳腺癌干細(xì)胞的干性和體內(nèi)成瘤能力,其可能是抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵分子。研究表明，TGF-β在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)與化療后腫瘤干細(xì)胞富集所引起的化療耐藥有關(guān)[31]。隨后的研究表明，同樣產(chǎn)生的EMT后細(xì)胞群也可呈現(xiàn)處某些間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。

綜上所述，乳腺癌中miRNA、TGF-β、EMT間相互聯(lián)系，三者對(duì)乳腺癌微環(huán)境及CSCs均有調(diào)控作用，它們間的聯(lián)系是一個(gè)復(fù)雜的、嚴(yán)密調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，其中CSCs是乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因，亦是乳腺癌患者的主要死亡原因。因此深入了解各調(diào)控機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的miRNA功能及針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行個(gè)體化治療將會(huì)為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后改善帶來(lái)新的進(jìn)展。