李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

非洲豬瘟病毒（ASFV）屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬病毒。病毒粒子有囊膜，大小約175～215 nm，只有1個血清型。ASFV為線狀雙鏈DNA病毒，基因組大小170～190 kb，兩端為可變區(qū)，中間為保守中心，包含ORF150個，可編碼150～200種蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白28種[1]。根據(jù)P72基因序列的差異，可分為24種不同的基因型，中國流行的主要是基因Ⅱ型。病毒對外界環(huán)境抵抗力強，尤其在濕冷環(huán)境可長期存活。ASFV宿主范圍較窄，僅感染豬致其發(fā)生非洲豬瘟（ASF），該病是一種高度接觸性傳染病，以高熱、厭食、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官廣泛出血及高死亡率為特征[2]，但通常傳播速度慢。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定ASF為必須通報的動物傳染病，中國則將其定為一類動物疫病[3-4]。ASFV感染豬只后可在其體內(nèi)大量增殖，但抗體產(chǎn)生速度較慢，且一般不產(chǎn)生中和抗體。

自2018年8月ASF首次報道以來，迅速席卷我國，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，還造成重大的經(jīng)濟、社會和政治影響[5-6]。目前尚無有效的商品化疫苗可用，也無有效治療藥物。其所引起的病變與豬瘟及細(xì)菌性敗血病等病變類似，因此，僅通過剖檢有時很難做出正確診斷，需借助實驗室方法確診。抗體檢測存在一定的缺陷，抗體產(chǎn)生的滯后性和抗體檢測不能判定現(xiàn)癥感染，故一般采取病原學(xué)方法進(jìn)行確診。由于方法本身局限性及國家相關(guān)政策等影響，傳統(tǒng)的病原分離，間接免疫熒光滿足不了臨床樣本檢測的需求，針對ASFV核酸的分子生物檢測方法是最適宜該病檢測方法。該病防控主要依靠撲殺感染動物、完善的生物安全措施，為滿足現(xiàn)場早期、快速、準(zhǔn)確排查ASF疫情，阻止疫情在國內(nèi)的進(jìn)一步蔓延的需求，需借助先進(jìn)、科學(xué)、經(jīng)濟的分子生物學(xué)檢測方法。本文闡述ASFV的分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展情況，為ASF的診斷及防控工作提供參考。

1 核酸探針

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補的原理，用能特異性識別堿基序列（靶序列）一段單鏈DNA（或RNA）分子作標(biāo)記，與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術(shù)。張鑫宇等對22株發(fā)表的非洲豬瘟病毒（ASFV）p72基因序列進(jìn)行比較，根據(jù)保守的基因序列，各設(shè)計、合成1條與保守區(qū)域互補的5'生物素標(biāo)記及3'烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針，并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上，制備納米金標(biāo)記探針，PCR擴增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列，變性后與上述生物素探針及標(biāo)記納米金探針進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物加入吸附鏈霉親和素的酶標(biāo)板，利用親和原理，捕獲雜交產(chǎn)物，銀染增強法對納米金標(biāo)記探針進(jìn)行信號放大，結(jié)果表明，制備的納米金探針經(jīng)銀染放大后，在酶標(biāo)板中形成肉眼可見的黑色沉淀，可實現(xiàn)有效檢測ASFV p72擴增基因，對核酸檢測敏感度為10 fmol·L-1[7]。

2 納米PCR

納米PCR技術(shù)是將納米材料應(yīng)用PCR所形成的一門新興技術(shù)，納米金粒子的應(yīng)用可提高酶的活性和穩(wěn)定性，改善非特異性擴增現(xiàn)象，提高PCR檢測特異性，縮短PCR反應(yīng)時間，檢測敏感性是常規(guī)PCR的100倍，使檢測更加準(zhǔn)確、可靠[8]。崔尚金等建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，該方法采用納米金顆粒作為熱導(dǎo)介子，提高了PCR反應(yīng)效率，采用該方法同時檢測ASFV、大腸桿菌、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬捷申病毒、豬腦心肌炎病毒等，結(jié)果只有ASFV能夠擴增出552 bp的目的片段[9]。敏感性實驗表明，納米PCR檢測技術(shù)是常規(guī)PCR檢測技術(shù)敏感性的1 000倍以上，最低核酸拷貝數(shù)檢出量可以達(dá)到10個拷貝。

3 多重PCR法

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優(yōu)點而廣泛用于臨床的快速診斷。任梅滲等參考PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、副豬嗜血桿菌（HPS）、胸膜肺炎放線桿菌（APP）以及多殺性巴氏桿菌（PM）標(biāo)準(zhǔn)毒株序列，選擇各病毒和細(xì)菌的保守序列分別設(shè)計7對特異性引物進(jìn)行多重PCR，各項優(yōu)化試驗結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)的退火溫度為51℃，各條引物濃度均為0.8 μmol·L-1時擴增的目的條帶效果最佳，用敏感性試驗檢測該反應(yīng)中各病毒的最小檢出量分別為：1.01×102（PRV）、1.48×103（CSFV）、1.07×104（ASFV）、9.73×103（PRRSV）、1.82×103（HPS）、1.65×103（PM）和 3.64×103（APP）copies·μL-1，在最優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行特異性試驗，結(jié)果未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，能檢出對應(yīng)病原的多種血清型，陰性對照均無非特異性擴增[10]。冷依伊等根據(jù)GenBank中登錄的ASFV、水皰性口炎病毒（VSV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV以及PRV參考病毒株序列，選擇各病毒的保守序列設(shè)計5對特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種可以同時快速檢測以上5種病毒的多重PCR檢測方法，結(jié)果顯示，該方法對不同的細(xì)菌或病毒模板擴增結(jié)果均為陰性，特異性強，敏感性試驗表明該方法對PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少檢出量分別為 8.82×103、6.87×104、5.71、4.93×104和4.32×102copies·μL-1，以上結(jié)果表明該方法快速、靈敏、特異性強[11]。

4 熒光定量PCR

熒光定量PCR（qPCR）融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，檢測速度快、敏感高，可直接觀察擴增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測擴增產(chǎn)物，減少了對環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結(jié)果。據(jù)信號基團(tuán)的不同，qPCR可以分為染料法和探針法兩種。曾少靈等依據(jù)ASFV較保守的VP73基因序列，設(shè)計特異性引物與探針，建立了ASFV實時熒光PCR檢測方法，并與OIE推薦用于檢測ASFV的實時熒光PCR和普通PCR方法進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該法檢測靈敏度與OIE熒光PCR方法相當(dāng)，但比普通PCR方法高出至少10倍。該法最低檢測限可達(dá)10 copies·μL-1病毒DNA，該法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，批內(nèi)CV值為0.61%～1.14%，批間CV值為1.37%～3.14%[12]。王建華等根據(jù)ASFV CP530R基因序列設(shè)計1對特異性引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種檢測ASFV的Taq-Man-MGB探針實時熒光PCR方法，并對該方法進(jìn)行了特異性、定量線性范圍、敏感性和重復(fù)性等試驗評價，結(jié)果表明，該方法僅對ASFV發(fā)生特異性擴增反應(yīng)，不與PRV、豬細(xì)小病毒（PPV）和PCV2、CSFV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、PRRSV和豬流感病毒（SIV）發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。用該方法檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)對照的線性范圍為6.1×102～6.1×109copies·μL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.449x+38.10，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999，最低可檢測到61個拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)對照分子，對5個不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)對照進(jìn)行雙份樣品的4次重復(fù)檢測，每個濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)對照的Ct值變異系數(shù)均小于2.0%，具有良好的重現(xiàn)性[13]。王建華等根據(jù)ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和高致病性PRRSV NSP2基因，分別設(shè)計3對引物和TaqMan探針，建立了能同時檢測這3種病毒的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，結(jié)果表明，該方法僅對ASFV、CSFV和HPPRRSV呈現(xiàn)特異性擴增，不與PRV、PPV和PCV2的DNA以及PEDV和SIV的cDNA發(fā)生交叉反應(yīng)，該方法對ASFV、CSFV和高致病性PRRSV的最低檢出量分別為61、11和41 copies·μL-1，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗的Ct值變異系數(shù)均＜2.5%，具有良好的重現(xiàn)性[14]。

5 微滴數(shù)字PCR

微滴數(shù)字PCR（ddPCR）是第三代PCR技術(shù)，其原理是通過油包水技術(shù)將預(yù)混的PCR體系分割成數(shù)萬個納米級微滴，每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子，作為一個獨立的擴增體系，通過熒光檢測每個微滴中的陽性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)[15]。根據(jù)泊松分布的原理以及出現(xiàn)熒光信號的微滴個數(shù)與比例，即可得出靶分子的起始濃度，從而實現(xiàn)靶分子的絕對定量[16]。不再需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，不依賴Ct值或內(nèi)參基因，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目，精確性更高。鄔旭龍等針對ASFV K205R基因設(shè)計一對特異性引物和Taq Man探針，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了ASFVqPCR和ddPCR檢測方法，并對兩種方法的線性關(guān)系、靈敏性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了評估，利用建立的ASFV檢測方法對163份我國內(nèi)和進(jìn)境的組織樣本及血清樣本進(jìn)行檢測，血清樣本經(jīng)商品化ASFV ELISA試劑盒復(fù)檢，評估不同方法檢測結(jié)果的符合率，結(jié)果顯示，建立的ASFV qPCR和dd PCR檢測方法線性關(guān)系較好（R2≥0.998），ddPCR的最低檢測限度可達(dá)到0.36 copies，在20 μL反應(yīng)體系中約為10拷貝/反應(yīng)，檢測靈敏度是qPCR的10倍[17]。ASFV ddPCR檢測方法具有很高的特異性和重復(fù)性，不與其他豬常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。王華等通過對GenBank中ASFV p72蛋白基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計合成了內(nèi)（FIP，BIP）、外（F3，B3）兩對引物，通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了非洲豬瘟LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，該方法在62℃恒溫60 min即可完成，最低可檢測到1×101copies·μL-1的病毒DNA，與常規(guī)PCR方法相比靈敏度高100倍，對ASFV、PCV2、PPV、PRV基因組DNA同時檢測，結(jié)果僅有ASFV出現(xiàn)條帶，而其他均未出現(xiàn)目的條帶[18]。田純見等根據(jù)ASFV高度保守的非結(jié)構(gòu)DNA聚合酶G1211R基因設(shè)計引物，建立了ASFV實時熒光LAMP方法，并與熒光PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該法檢測靈敏度達(dá)21 pg，優(yōu)于熒光定量PCR方法，重復(fù)性實驗LAMP檢測批內(nèi)和批間變異系數(shù)均＜5%，該法特異性良好，與PCV2、PRV、CSDFV、PRRSV及昆蟲核酸無交叉反應(yīng)[19]。還有一種檢測ASFV的LAMP擴增方法。該方法能在58℃恒溫條件下50 min內(nèi)完成檢測反應(yīng)，敏感性實驗表明，最低可檢出5 copies·μL-1的ASFV核酸，該法與健康豬樣本、PRRSV和PPV核酸樣本不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性強。所建立的檢測方法反應(yīng)結(jié)束后，無需開蓋，可避免氣溶膠造成的污染。通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判讀結(jié)果，若反應(yīng)液呈黃色，結(jié)果判為陽性，若反應(yīng)液呈橙紅色，結(jié)果判為陰性。

7 重組聚合酶擴增技術(shù)

重組酶聚合酶擴增（RPA）技術(shù)是2006年由英國公司TwistDx Inc研發(fā)的一種核酸擴增技術(shù)[20]。該法利用重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白等三種酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過程，25～42℃等溫條件下，30 min內(nèi)實現(xiàn)對靶基因的指數(shù)級擴增，不需要昂貴的儀器設(shè)備，產(chǎn)物的檢測可通過凝膠電泳、熒光檢測儀、側(cè)向流試紙條（LFD）、生物芯片等多種不同方法，具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短、結(jié)果讀取多元化、操作簡便等優(yōu)點，能滿足疫病快速現(xiàn)場檢測的需求[21]。王建昌等根據(jù)ASFV P72基因序列，設(shè)計引物，建立了一種檢測ASFV的RPA等溫擴增方法，結(jié)果表明，該法在38℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)30 min，即可實現(xiàn)對目的片段的有效擴增，以包含ASFV P72基因的ORF質(zhì)粒為模板，RPA的檢測限達(dá)到102copies，同OIE推薦的熒光PCR法最低檢測限一致，該法僅特異性擴增ASFV P72基因，對口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2基因組c DNA或DNA沒有擴增[22]。哈登楚日亞等針對ASFV p72基因設(shè)計了3組引物和探針，通過不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了ASFV實時熒光RPA檢測方法，結(jié)果顯示，該法在39℃恒溫條件下20 min內(nèi)可完成檢測反應(yīng)，最低可檢測10個copies的DNA分子，且與CSFV、PCV2、PPV、PRV均無交叉反應(yīng)，檢測5.5×106～5.5×100copies·μL-1共7個稀釋度樣品在各時間點的熒光強度，變異系數(shù)范圍在0.38%～28.30%[23]。繆發(fā)明等建立了一種簡便、快捷的現(xiàn)地檢測ASFV的方法，該法聯(lián)合RPA和LFD技術(shù)，針對ASFV P72基因保守區(qū)域，設(shè)計兩條引物和一條nfo探針，下游引物5'端標(biāo)記生物素，nfo探針5'端異硫氰酸熒光素或6-羧基熒光素，3'端帶有阻斷物，序列內(nèi)部標(biāo)記THF分子，通過引物濃度、RPA反應(yīng)時間和溫度等條件的優(yōu)化建立了一種可以用于ASFV現(xiàn)地檢測的RPA-LFD方法。該檢測方法在38～46℃恒溫反應(yīng)10 min即可實現(xiàn)對ASF目的基因的有效擴增與CSFV、PCV2、豬乙型腦炎病毒（JEV）、PEDV、PRRSV、PRV等均無交叉反應(yīng)，RPA擴增產(chǎn)物直接用LFD肉眼觀察，最低檢測限為102拷貝/反應(yīng)，靈敏度與TaqMan熒光定量PCR相當(dāng)[24]。

8小結(jié)

非洲豬瘟是國際公認(rèn)對養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病，世界各國均高度重視，豬場一旦發(fā)病，按國家政策應(yīng)全群撲殺。目前該病在全國均有流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊，使養(yǎng)豬人喪失養(yǎng)豬信心。中國是以散戶為主的養(yǎng)殖模式，居民普遍喜食鮮肉，大規(guī)模生豬調(diào)運，注定非洲豬瘟的防控工作必將是一場持久戰(zhàn)。雖然該病已流行近百年，但對其致病機理尚不明確，因病原獨特性質(zhì)，疫苗研究未取得突破性進(jìn)展，甚至消毒劑及診斷制品的研究還不完善，還有大量工作要做。該病雖然全國范圍多點散發(fā)，但傳播速度非常慢，早期診斷后，通過相應(yīng)的消毒及生物安全防控措施可將豬場損失降低。為開展非洲豬瘟分子流行病學(xué)調(diào)查，了解病毒傳播途徑，掌握疾病流行動態(tài)，防止疫情擴散和蔓延，需依靠大量快速、敏感、成本低、操作簡單的高質(zhì)量檢測試劑。

當(dāng)前ASFV分子生物學(xué)檢測方法有多種，但各有利弊，探針檢測法雖然可實現(xiàn)高通量檢測，一次可檢測大量樣本，但操作較復(fù)雜。納米PCR方法雖然檢測速度快、敏感性高、特異性強，但不能實現(xiàn)對病原的定量檢測，且納米材料不易獲得。多重PCR方法雖然可實現(xiàn)對多種疾病的快速篩查，但因所用引物眾多，反應(yīng)條件很難兼顧，致檢測敏感性不高，易導(dǎo)致漏檢。熒光PCR檢測方法較成熟，檢測速度快，可實現(xiàn)病原定量檢測，但染料法特異性不好，很難篩選到好的引物，探針法探針合成價格較貴，且需要價格昂貴的儀器設(shè)備，很難在基層大面積推廣應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但引物設(shè)計復(fù)雜，且靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對非特異性擴增也很難鑒別。微滴數(shù)字PCR探針的設(shè)計同熒光PCR，原理復(fù)雜，操作對人員要求高，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低可檢測單拷貝核酸分子，可實現(xiàn)待檢靶樣品核酸絕對定量，目前普及程度不如熒光PCR，同樣不適合基層檢測。重組聚合酶擴增技術(shù)所用試劑價格昂貴，檢測成本高，引物設(shè)計規(guī)則不明。

當(dāng)前對ASF無有效疫苗和治療藥物可用，只能靠嚴(yán)格的生物安全措施防控，制定嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格執(zhí)行，規(guī)范引種與賣豬流程，進(jìn)出車輛嚴(yán)格消毒。人員按規(guī)定隔離、消毒和換洗衣物。加強豬飼養(yǎng)管理，提供適宜溫度、濕度，降低豬只飼養(yǎng)密度，豬舍分割成小單元飼養(yǎng)，減少豬群應(yīng)激。進(jìn)出豬場飼料、藥品、疫苗、物資等嚴(yán)格熏蒸消毒，豬舍定期清理糞尿，做好滅蚊蠅及滅鼠工作。選擇質(zhì)量有保證的廠家對ASFV有確定效果的消毒劑，如過硫酸鉀復(fù)合物、戊二醛等，消毒劑配制濃度要合理，保證消毒時間，并注意外界環(huán)境溫度，部分消毒劑在低溫環(huán)境無效。

因中國流行的ASFV為強毒株，豬群常在抗體還未產(chǎn)生或抗體滴度不高時豬只已死亡，全球?qū)Ψ俏炼际菗錃⒄?，所以?dāng)前檢測抗體的意義并不大，主要針對抗原檢測。隨著疾病的流行，ASFV可能會變?yōu)槿醵局辏i只出現(xiàn)隱性帶毒情況，到時檢測抗體可能更有意義。雖然針對ASFV病原檢測方法有多種，但當(dāng)前國家推薦的檢測方法是熒光PCR，國家農(nóng)業(yè)部組織了比對，推薦了一些質(zhì)量符合要求的廠家。檢測時可選取全血、血清、唾液、糞便、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟等樣本，通常唾液中最早出現(xiàn)病毒，適合疾病早期篩查，一定要把握檢測時間，早發(fā)現(xiàn)，早剔除，減少豬舍中病原載量，否則可能就沒有意義。另外對檢測的唾液樣品最好不離心、不凍融，盡早檢測，以提高檢出率，否則可能會因核酸降解及病毒量減少造成漏檢?；铙w檢測排查病原是可采集血樣，采樣時一定要防止豬只見交叉污染，全血的檢出率要高于血清。雖然公認(rèn)病豬脾臟為檢測的最佳組織，但一般不建議對疑似發(fā)病豬只解剖，以免造成大的污染面，可在腹股溝淋巴結(jié)切開一小口，取少量淋巴結(jié)檢測。如果條件允許的話不要選擇免核酸提取試劑盒，免核酸提取試劑盒雖然對病毒含量高的樣本擴增無影響，但對環(huán)境采樣或?qū)Σ《竞康偷臉颖?，少了核酸的富集和純化過程，必然會減少樣本陽性檢出率。核酸手提法操作繁瑣，時間長，對人員和儀器設(shè)備要求高，商品化核酸提取試劑盒分為柱式提取法和磁珠提取法兩種，磁珠法更適合大量樣本用核酸自動提取儀提取，不同廠家柱式法試劑提取效率不同。便攜式熒光檢測試劑及適合常溫保存和運輸?shù)脑噭┰诨鶎蛹膊〉脑\斷中必將發(fā)揮巨大的作用。

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，科研工作者一定會開發(fā)出更多價廉、質(zhì)優(yōu)的檢測試劑，以滿足基層豬場及實驗室檢測需求，從而更好地防控非瘟，減少豬場損失，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。