李笑櫻，孫鐵虎，郭 杰，陳 博，佟 毅，潘喜春

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.吉林中糧生化有限公司（玉米深加工國(guó)家工程研究中心），長(zhǎng)春 130033；3.中糧集團(tuán)中糧生化專業(yè)化平臺(tái)，北京 100005）

真菌毒素是真菌在適宜溫濕度條件和基質(zhì)中產(chǎn)生的具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在糧食及飼料衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域又稱為霉菌毒素[1]。目前已知的霉菌毒素有300多種，其中污染范圍較廣、毒性較大的主要有黃曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）、赭曲霉毒素（OTA）、伏馬菌素及T2毒素等。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）估算，全世界每年約有25%的谷物受霉菌毒素污染，約2%的農(nóng)產(chǎn)品因霉變而失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給農(nóng)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。被霉菌污染的飼料和糧食顏色、氣味發(fā)生改變，脂肪變質(zhì)，適口性變差，因而動(dòng)物的采食量下降，影響生長(zhǎng)性能；霉菌毒素還會(huì)引起動(dòng)物繁殖功能紊亂，造成繁殖性能降低；降低免疫細(xì)胞活性，導(dǎo)致免疫抑制；還可抑制蛋白質(zhì)和酶的合成，破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，損害動(dòng)物的肝腎、腸道、神經(jīng)等器官和組織[3-7]。霉菌毒素在動(dòng)物產(chǎn)品中（如肉蛋奶中）也會(huì)有一定殘留，再通過(guò)食物鏈對(duì)人體造成危害。因此，早期對(duì)飼料及食品中的霉菌毒素進(jìn)行監(jiān)控和防治，從而降低霉菌毒素對(duì)畜牧業(yè)的危害、減少經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)保障消費(fèi)者身體健康和國(guó)家糧食食品安全意義深遠(yuǎn)。我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 13078-2017）和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017）對(duì)飼料及原料和食品中各霉菌毒素的最大允許量都制定了嚴(yán)格的限制標(biāo)準(zhǔn)。

1 霉菌毒素的檢測(cè)方法

霉菌毒素的現(xiàn)有檢測(cè)方法主要有兩大類：確認(rèn)方法和快速方法。確認(rèn)方法又叫儀器方法，主要基于理化儀器設(shè)備，如薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和各種聯(lián)用技術(shù)，如氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）等。儀器分析法因其靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠而受到檢測(cè)機(jī)構(gòu)的青睞，并作為霉菌毒素的常用確證檢測(cè)方法。但這種方法需要較為昂貴的精密設(shè)備，配備專業(yè)的實(shí)驗(yàn)操作人員，且檢測(cè)樣本成本高、樣品前處理復(fù)雜、操作步驟煩瑣，無(wú)法滿足基層單位對(duì)批量樣品的快速篩查檢測(cè)的需求。同時(shí)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，糧油食品及飼料相關(guān)的貿(mào)易流通業(yè)務(wù)日益頻繁，各級(jí)質(zhì)量控制部門對(duì)于樣品檢測(cè)的壓力也越來(lái)越大，這就要求對(duì)霉菌毒素檢測(cè)向快捷準(zhǔn)確方向發(fā)展[8-9]。

2 霉菌毒素快速檢測(cè)方法

現(xiàn)在較多的快速檢測(cè)方法主要基于免疫化學(xué)，包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELlSA）和免疫層析方法。酶聯(lián)免疫吸附法（ELlSA）的基本原理是將已知的抗原或抗體固定在固相載體上，再用做好標(biāo)記的酶與底物反應(yīng)顯色，以此來(lái)判斷是否有相應(yīng)的免疫反應(yīng)[10]。該法的優(yōu)點(diǎn)是免疫反應(yīng)特異性強(qiáng)、靈敏度較高、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)便，通過(guò)酶標(biāo)儀讀取檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且穩(wěn)定，現(xiàn)已成為最常見(jiàn)的快速檢測(cè)飼料和食品中霉菌毒素的方法。

免疫層析法主要通過(guò)免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，免疫層析試紙條主要由樣本墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水墊及黏性底板等部分組成。試紙條上NC膜固定有測(cè)試線和質(zhì)控線；樣品溶液加入至樣本墊，預(yù)先在結(jié)合墊上噴涂抗體標(biāo)記物，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用在層析試紙條上移動(dòng)，經(jīng)過(guò)檢測(cè)線時(shí)會(huì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，而游離的抗體標(biāo)記物進(jìn)一步與質(zhì)控線發(fā)生免疫反應(yīng)，已著色的標(biāo)記物在短時(shí)間（5～10 min）便可顯示出結(jié)果；測(cè)試線的顯色深淺或吸光度大小進(jìn)行定性或半定量判定，檢測(cè)結(jié)果往往存在一定誤差。

市面上的免疫層析試紙條標(biāo)記物材料依據(jù)光譜特性的不同可分為兩類：一類是吸收光譜型材料，包括膠體金、膠體碳、磁珠等；另一類是發(fā)射光譜型材料，包括量子點(diǎn)及量子點(diǎn)微球、熒光微球以及上轉(zhuǎn)換磷光納米粒子等，其中膠體金免疫層析法應(yīng)用較為普遍[8]。膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，利用抗原抗體反應(yīng)發(fā)明的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸水溶液在還原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的金溶膠狀態(tài)。利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)或其他多種生物大分子物質(zhì)（如霉菌毒素、抗生素、激素、核酸、多肽綴合物等）的正電荷基團(tuán)的靜電吸引而形成牢固的結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)所標(biāo)記物質(zhì)的生物活性卻無(wú)顯著影響[11]。

由于霉菌毒素屬半抗原，不具有免疫原性，因此在制備抗體前首先要合成霉菌毒素—載體蛋白結(jié)合物免疫原。由于各種霉菌毒素分子結(jié)構(gòu)不同，其在絕大部分情況下不具備連接反應(yīng)基因，因此霉菌毒素分子首先要經(jīng)過(guò)衍生過(guò)程，而衍生所需要一定的連接化學(xué)反應(yīng)條件，這種反應(yīng)條件一定不能導(dǎo)致其半抗原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，之后再通過(guò)連接物與載體蛋白連接[11]。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）和卵清蛋白（OVA）等。制備好的半抗原結(jié)合物在免疫動(dòng)物前，要測(cè)定結(jié)合物中半抗原數(shù)目，因?yàn)榻Y(jié)合物中半抗原分子數(shù)目太多或太少，都會(huì)導(dǎo)致誘發(fā)抗體的能力較差。

基于膠體金為標(biāo)記材料的免疫層析法生產(chǎn)的霉菌毒素檢測(cè)試紙條是目前應(yīng)用最廣泛的一種快速檢測(cè)產(chǎn)品，并已大量應(yīng)用于AFB1、ZEN、DON以及OTA等霉菌毒素的快速檢測(cè)。且該技術(shù)由于無(wú)需精密儀器、方法簡(jiǎn)單快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于飼料和糧食現(xiàn)場(chǎng)快檢和大規(guī)模樣品篩查，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用[12-14]。

3 霉菌毒素膠體金快速檢測(cè)方法在實(shí)際中的應(yīng)用

姚佳等以AFB1、DON和ZEN分析了3種毒素膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的最低檢出限分別為0.005、0.5和0.3 mg·kg-1，通過(guò)回收率和變異系數(shù)評(píng)價(jià)了該快檢方法的準(zhǔn)確性和精密度，并進(jìn)一步將該檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于寧夏稻米毒素的快速檢測(cè)，結(jié)果表明，3種毒素的膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條具有較高靈敏度和特異性，并可通過(guò)肉眼直接判讀結(jié)果的特性，適用于稻米的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[15]。孫清研究了一種可直接檢測(cè)油中AFB1的免疫層析方法，其按一定比例混合植物油和純凈水，用免疫層析試紙條檢測(cè)，可通過(guò)肉眼確認(rèn)油中的AFB1含量，該方法最低檢測(cè)限可達(dá)1.5 μg·kg-1，與國(guó)標(biāo)法對(duì)比其準(zhǔn)確性相對(duì)較高[16]。該方法不僅可用于實(shí)驗(yàn)室中糧油AFB1檢測(cè)，也可用于家庭中植物油安全檢測(cè)。由于近幾年食品安全事件頻發(fā)，牛奶中黃曲霉毒素的快速檢測(cè)成為了關(guān)注的重點(diǎn)。Wang等研制出一種用于檢測(cè)乳及乳制品中的AFM1的納米金免疫層析試紙條，用該試紙條檢測(cè)了15種乳及乳制品中AFM1含量，所需時(shí)間僅10 min，檢測(cè)限為0.028 ng·mL-1，并檢測(cè)出其中6種乳及乳制品受到輕微的AFM1污染，發(fā)現(xiàn)所有樣品中AFM1含量均＜1 ng·mL-1[17]。

以上列舉應(yīng)用多為定性檢測(cè)，這些檢測(cè)因肉眼觀察主觀性較強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性也相對(duì)較差。近年來(lái)隨著各種技術(shù)手段綜合應(yīng)用，多學(xué)科之間交叉滲透，膠體金層析快速檢測(cè)技術(shù)也有了較大的改進(jìn)和提高。

王海彬成功研制出黃曲霉毒素膠體金免疫層析速測(cè)儀，該速測(cè)儀結(jié)合光、機(jī)、電、計(jì)算機(jī)等技術(shù)手段，膠體金免疫層析試紙條作為一級(jí)傳感器，面陣CMOS圖像芯片作為二級(jí)傳感器，將黃曲霉毒素免疫層析快速檢測(cè)試紙條的定性結(jié)果進(jìn)行快速量化讀取，獲取待檢測(cè)黃曲霉毒素的定量信息，從而對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行快速定量檢測(cè)，檢測(cè)花生樣品結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為88%～119%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分布為6%～27%，快速定量檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法比對(duì)后發(fā)現(xiàn)兩種方法相對(duì)誤差≤17%，同時(shí)還建立了花生中黃曲霉毒素總量（B1+B2+G1+G2）的快速定量檢測(cè)技術(shù)[18]。張兆城等研發(fā)了花生、玉米、大米、小麥等糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素總量、AFM1和AFB1高靈敏、高特異性系列檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)研制了系列配套試紙條和黃曲霉毒素單光譜成像檢測(cè)儀和黃曲霉毒素流動(dòng)滯后免疫時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀[19]。王督等研發(fā)的檢測(cè)花生、玉米、大米、小麥等糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1的定量分析方法，檢測(cè)結(jié)果表明，4種樣品檢測(cè)的線性范圍為1.0～20.0 μg·kg-1，r2＞0.97，方法的定量限為1.0 μg·kg-1，樣品加標(biāo)回收率為75%～106%，RSD＜20%，且此法與免疫親和柱凈化-HPLC法相比，相對(duì)誤差＜15%，樣品檢測(cè)時(shí)間只需15 min，檢測(cè)成本也低于其他方法[12]。

王瑩等通過(guò)合成玉米赤霉烯酮（ZEN）人工抗原，制備抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體（mAb），并以此為基礎(chǔ)建立膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，與膠體金讀數(shù)儀配合使用，用于快速定量檢測(cè)玉米和小麥樣品中ZEN，結(jié)果表明，檢測(cè)的玉米和小麥樣品，ZEN的檢測(cè)限為4.7 μg·kg-1，定量限13.9 μg·kg-1，線性范圍 14.5～500 μg·kg-1，相關(guān)系數(shù) r=0.996 4，用高效液相色譜法進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)快檢方法檢測(cè)樣品的準(zhǔn)確度為80.1%～149.7%，變異系數(shù)范圍7.3%～19.6%，并用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，表明兩種方法之間無(wú)顯著性差異[20]。宋青龍等應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)和定量讀數(shù)儀技術(shù)研制出一種快速定量檢測(cè)谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒以膠體金標(biāo)記高特異性單抗，與偶聯(lián)抗原進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定適宜條件，同時(shí)通過(guò)與對(duì)照線和試驗(yàn)線的顏色對(duì)比，應(yīng)用膠體金定量讀數(shù)儀，對(duì)樣本中黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法便捷、穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果可定量，避免了人眼判別的差異，且與常見(jiàn)霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，樣品檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差＜20%[21]。

對(duì)市面上幾款膠體金免疫層析產(chǎn)品進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)品大多也有配套的分析檢測(cè)儀，儀器中有樣品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可快速讀取檢測(cè)樣品中霉菌毒素含量。檢測(cè)樣本量沒(méi)有特殊要求，既可檢測(cè)單個(gè)或少量樣本，也可檢測(cè)大量樣本?？蓹z測(cè)基質(zhì)成分較為單一的原料樣品（如糧食、油料、飼料原料等）也可檢測(cè)基質(zhì)成分較為復(fù)雜的樣本（如酒糟、糧食發(fā)酵產(chǎn)品、成品飼料等），前處理過(guò)程安全快捷，無(wú)需對(duì)檢測(cè)提取液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，可用于實(shí)驗(yàn)室霉菌毒素快速檢測(cè)。另外，配套的定量檢測(cè)儀器可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)自動(dòng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取、數(shù)據(jù)傳輸、軟件升級(jí)、問(wèn)題故障診斷、質(zhì)量控制等。對(duì)使用這些快檢產(chǎn)品的客戶進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)這些快檢產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用中存在一些缺陷；膠體金層析試紙條生產(chǎn)廠家生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控不嚴(yán)，讀數(shù)儀對(duì)快檢卡顏色深淺不敏感導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏差較大，檢測(cè)環(huán)節(jié)和快檢卡本身受檢測(cè)環(huán)境溫度濕度影響較大，沒(méi)有配套完善的儀器確認(rèn)方法，數(shù)據(jù)溯源上傳功能故障頻發(fā)，檢測(cè)卡成本過(guò)高等，問(wèn)題還有待解決。

4小 結(jié)

免疫層析試紙條因操作步驟簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、無(wú)需昂貴大型儀器等特點(diǎn)，在批量樣品的快速篩查方面具有極大的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，已廣泛應(yīng)用于糧油及飼料中霉菌毒素的快速檢測(cè)[22]。隨著其他新型標(biāo)記材料的應(yīng)用，今后將會(huì)進(jìn)一步提高免疫層析方法的檢測(cè)準(zhǔn)確性和精確性。另外，霉菌毒素在糧油和飼料中通常多種共存，建立對(duì)多種毒素的快速、高通量檢測(cè)技術(shù)，將大大節(jié)約成本，提高檢測(cè)效率，因此基于免疫層析平臺(tái)的多種毒素檢測(cè)技術(shù)也必將成為今后的發(fā)展方向之一。霉菌毒素除了在糧食和飼料中存在以外，在其他食品飲品領(lǐng)域（如發(fā)酵類食品、茶葉、菌糠等）同時(shí)存在安全隱患，未來(lái)對(duì)這些領(lǐng)域中霉菌毒素的檢測(cè)也應(yīng)該得到重視[23]。各級(jí)衛(wèi)生部門和食品安全管理部門應(yīng)重視霉菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和監(jiān)測(cè)預(yù)警等工作，建立霉菌毒素快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)管理部門應(yīng)預(yù)防嚴(yán)控食品的來(lái)源、加工、銷售等環(huán)節(jié)，精準(zhǔn)掌握其中霉菌毒素?cái)?shù)據(jù)信息，綜合管控治理。同時(shí)引導(dǎo)幫助廣大消費(fèi)者樹立食品安全意識(shí)和正確解讀國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)，引導(dǎo)消費(fèi)者購(gòu)買安全、健康、綠色的食品[24]。