胡麗玲

(三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 藥學部， 湖北 宜昌 443003)

芒果苷(mangiferin，MGF)為雙苯并吡喃酮結構的碳糖苷(見圖1)，富含于高等植物和芒果果實的不同部位，如果皮、莖、葉、樹皮、果仁和果核等[1]。其具有抗病毒、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗衰老、免疫調節(jié)、保肝、鎮(zhèn)痛等多種功能，是一種極具發(fā)展前景的抗氧化劑[2-4]。然而，芒果苷不易溶解，生物利用度低，據報道，芒果苷的溶解度為0.111 mg/mL，口服生物利用度僅為1.2%，從而限制了其臨床應用，且目前還沒有相關產品上市[5]。

聚合物膠束是一種倍受關注的新型給藥系統，通過核-殼結構中的疏水性內核包載疏水性藥物，從而增加載藥范圍、增加藥物的穩(wěn)定性、提高藥物組織滲透性并延長藥物體內滯留時間[6]。由于膠束為納米制劑，可通過腫瘤組織的高通透性和滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)在腫瘤部位蓄積，實現藥物的靶向性，是很有發(fā)展前景的藥物載體[7]。目前尚無芒果苷聚合物膠束研究的相關報道。本研究旨在探索其制備處方，為芒果苷聚合物膠束的新藥開發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

MGF購自武漢市合中生化制造有限公司；芒果苷標準品(mangiferin RS)(中國藥品生物制品檢定所，純度98.4%，批號111607-200402)；甲醇(methy alcohol，MeOH) (色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；乙腈(acetonitrile)(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；無水乙醇(ethanol) (分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；冰醋酸(glacial acetic acid，HAc)(分析純，天津博迪化工股份有限公司)； 1,2-丙二醇(1,2 propylene glycol, 1,2-PG)(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；磷酸氫二鉀(dipotassium phosphate)(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠)；四氫呋喃( tetrahydrofuran, THF)(分析純，天津博迪化工股份有限公司)；乙酸乙酯(ethyl acetate, EtAc) (分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；氯仿(cloroform)(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；鹽酸(HCl)(分析純，天津博迪化工股份有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；正辛醇(octanol)(分析純，天津博迪化工股份有限公司)；葡甲胺(meglumine) (分析純，阿拉丁)；15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯(HS-15)(分析純，BASF，德國)；氫化蓖麻油(RH40)(分析純，BASF，德國)；泊洛沙姆F68 (分析純，BASF，德國)；D-α生育酚聚乙二醇 1000 琥珀酸酯(TPGS)(分析純，EASTMAN，美國)；聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)(分析純，BASF，德國)。

1.2 儀器

光學顯微鏡(Motic R107M，中國)；離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司，中國)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司，中國)；KQ5200E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國)；WG-71電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，中國)；pHS-2C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠，中國)；BSA124S電子分析天平(賽多利斯，德國)；UV5100紫外/可見分光光度計(安徽皖儀股份有限公司，中國)；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠，中國)；SZ-93自動雙重蒸水器(上海亞榮生化儀器廠，中國)；高效液相色譜系統(L-7110輸液泵、L-7420紫外檢測器，Hitachi，日本)；PY000202加熱磁力攪拌(IKAR，德國)；ZHWY-110X30往返式水浴恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)；紅外光譜儀(Bruker，德國)。

1.3 芒果苷原料藥預處理

芒果苷原料藥用研缽研細，過300目篩，60℃烘干，置真空干燥器中備用。

1.4 芒果苷檢測波長的確定

以甲醇為溶媒配制適宜濃度的芒果苷標準品溶液和芒果苷原料藥溶液，于紫外-可見分光光度計200～600 nm波長掃描。

配置0.01%Soluplus、0.1%Soluplus、1.0%Soluplus、1.0%F68、1.0%HS15、1.0%RH40、1.0%TPPGS水溶液，于紫外-可見分光光度計200～600 nm波長掃描。

1.5 芒果苷檢測條件的確定

精確稱取芒果苷標準品50 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇定容，取適量溶液離心，取上清液，高效液相色譜法檢測；同理，準確稱取適量原料藥，甲醇定容，高效液相色譜法測定濃度。色譜條件：C18色譜柱(Haito Pack ODS，5 μm，100 mm×4.6 mm)；流動相為乙腈：0.1%冰醋酸(16:84)；檢測波長365 nm；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min。

1.6 芒果苷標準曲線的建立

精密稱取芒果苷標準品1.080 mg，10 mL容量瓶，DMF溶解定容，制備成芒果苷標準品儲備液。精密移取芒果苷儲備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、1 mL，于10 mL容量瓶中，DMF定容，分別制備出濃度為10.8 μg/mL、21.6 μg/mL、43.2 μg/mL、54 μg/mL、64.8 μg/mL、108 μg/mL的芒果苷溶液。高效液相色譜法測定芒果苷峰面積，同前述色譜條件。

1.7 精密度實驗

精密移取芒果苷儲備液適量，用DMF稀釋配制低、中、高 3 個濃度的對照品溶液(10.8 μg/mL、54 μg/mL、108 μg/mL)，按前述色譜條件進樣，測定峰面積，連續(xù)測定3 d，每天連續(xù)測定3次，計算日內精密度和日間精密度。

1.8 回收率實驗

精密吸取相應比例的空白聚合物膠束溶液各3份，加入芒果苷儲備液，用DMF分別稀釋至濃度10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，按前述色譜條件進樣，測定峰面積。代入標準曲線方程計算回收率。

1.9 芒果苷表觀溶解度測定

研究芒果苷在不同體系當中的溶解度，取芒果苷適量，各溶劑體積為2 mL，超聲配制成懸濁液，間隔2 h超聲5 min，至24 h后，各取1 mL溶液于1.5 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋至適宜濃度，高效液相色譜法同前述色譜條件。

1.10 芒果苷的油水分配系數測定

1.10.1 制備正辛醇飽和的水和水飽和的正辛醇

取適量雙重蒸餾水以及pH值分別為2、4、6、8的PBS，分別與正辛醇(1∶1，v/v)混合，于50 mL離心管中，水浴搖床，100 r/min，37℃下振搖24 h，充分混合，分別得到水飽和的正辛醇與正辛醇飽和的各pH值的水相；停止振搖，靜置，待兩相分層后，將注射器吸滿空氣后，針頭伸入下層水相中，排出空氣，吸取水相，注射器移出，拔掉針頭，得到未被正辛醇污染的水相，離心取上清液。收好兩相備用。

1.10.2 芒果苷-水飽和正辛醇溶液的制備

取過量芒果苷于水飽和的正辛醇中，水浴搖床37℃，100 r/min，振搖24 h，得芒果苷的水飽和正辛醇溶液。保留適量該溶液，用于測量水飽和正辛醇中芒果苷總濃度C。

1.10.3 油水分配系數的測定

將適量正辛醇飽和的水加入到“(2)”制備得到的芒果苷-水飽和正辛醇溶液中(1∶1，v/v)，37℃水浴搖床，100 r/min，充分振搖24 h，取下層水相[操作方法同“1.10.1”]，得到經過油水分配后的芒果苷水溶液，離心取上清液，用于測量水相中芒果苷濃度Cw，Co=C-Cw，油水分配系數Po/w= Co/Cw。

1.11 芒果苷-Soluplus膠束的制備

1.11.1 空白膠束的制備

稱取100 mg的Soluplus，加入適量雙重蒸餾水，磁力攪拌至完全溶解。Soluplus在水中緩慢溶解，攪拌1 h后，溶液帶有藍色乳光，丁達爾效應顯著。

1.11.2 芒果苷-Soluplus膠束的制備

以上述溶解性實驗為依據，考察不同的溶劑(水、甲醇等)、不同表面活性劑(RH40、TPGS)、不同Soluplus用量，對膠束形成以及芒果苷含量的影響。向各組分中加入略過量的芒果苷，磁力攪拌24 h，得到各比例芒果苷膠束溶液。采用高效液相色譜法，測定芒果苷含量，色譜條件同前。

2 結果

2.1 芒果苷的波長測定

由圖2A可知，芒果苷λmax為259 nm，芒果苷原料藥純度基本符合標準。同時，從圖中可知芒果苷在λ319 nm和λ365 nm處也有紫外吸收峰。由圖2B可知，輔料在芒果苷最大吸收波長λmax259 nm處，均有不同程度的吸收。

除1%Soluplus溶液外，其余含量1%的輔料溶液在該波長紫外吸收幾乎為零，可忽略輔料吸收的影響，而1%Soluplus溶液經過稀釋10倍、100倍后紫外吸收明顯降低，可以忽略。由此，確定芒果苷的測定波長為λ365 nm。后續(xù)實驗中所涉及到的Soluplus溶液均進行適宜倍數的稀釋，再進行測定。

2.2 芒果苷液相專屬性圖譜

由圖3可見，在“1.5”項色譜條件下，芒果苷標準品色譜與原料藥色譜在相應保留時間處有一相同的色譜峰，峰形良好。

2.3 芒果苷的含量測定結果

芒果苷濃度在10 μg/mL～110 μg/mL時，線性相關性良好，回歸方程為y=22 730x-98 694(R2=0.998 1)，結果見圖4。日內精密度RSD分別為0.98%、1.37%、1.04%，日間精密度RSD分別為1.09%、1.12%、0.97%，精密度符合方法學要求。低、中、高3個濃度的回收率分別為106.55%、99.72%、101.23%，RSD為0.85%、0.53%、0.36%(n=3)，表明回收率符合方法學要求。

2.4 芒果苷的表觀溶解度

在乙腈、氯仿、乙酸乙酯等低極性或非極性有機溶劑中，高效液相色譜法檢測時，芒果苷無檢測峰出現(見圖5A)，說明芒果苷在此類溶劑中的溶解度低。在不同pH水溶液實驗組中，芒果苷溶解度受pH的影響較大(見圖5B)，尤其是pH為8時，溶液呈亮黃色，粘稠狀。向芒果苷水溶液加入表面活性成分，結果發(fā)現RH40和TPGS的增溶效果較好，可應用于后續(xù)實驗(見圖5C)。芒果苷與Soluplus的水溶液，具有膠束的淡藍色乳光，有丁達爾效應，呈現膠束狀態(tài)(見圖5D)，提示芒果苷含量較高。

2.5 芒果苷的油水分配系數

芒果苷的溶解性受溶液pH的影響很大。低pH值時，芒果苷為游離形式，脂溶性強；高pH值時，芒果苷為離子形式，水溶性強，見表1。

2.6 芒果苷-Soluplus膠束中芒果苷含量

實驗結果顯示，Soluplus含量0.5%～3.0%的水溶液中，含量為2.5%時，對芒果苷增溶效果最明顯(見圖6)，因此確定Soluplus含量為2.5%。當甲醇作為溶劑時，雖然芒果苷溶解度很高，但是Soluplus完全溶解，溶液透明，無乳光以及丁達爾效應，不能形成膠束，甲醇不適合作為溶劑使用。TPGS前后增溶效果不明顯，無繼續(xù)使用的價值，而RH40效果較好，可加入少量RH40增溶。

表1 芒果苷在不同酸堿度下的Po/w值和log Po/w值

3 討論

聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)，由13%聚乙二醇6000、57%乙烯基己內酰胺和30%乙酸乙烯酯共聚而成(化學結構式見圖7)，是一種較新的賦形劑[8]。其最初是為了通過熱熔擠出技術制造難溶性藥物的固體溶液而設計的[9]，具有很強的固體特性和兩親性，平均分子量90 000 g/mol～140 000 g/mol[10]。Soluplus毒性低、安全性好，具有增溶、助懸、空間穩(wěn)定等作用，在提高難溶性藥物溶出速率和生物利用度等方面展示出良好的應用前景。目前已有多篇文獻報告了Soluplus在聚合物膠束、固體分散體、藥物納米晶體、過飽和自乳化給藥系統等領域中的應用[10-12]。

芒果苷溶解性隨溶劑極性變化而變化，波動較大，易溶于極性溶劑，難溶或不溶于非極性溶劑[5]。有研究報道THF對難溶性藥物具有增溶作用[13,14]，本研究顯示芒果苷在THF中溶解較好，可能與芒果苷中的羥基與THF中的氧原子結合成氫鍵有關。在不同pH水溶液實驗組中，芒果苷溶解度受pH的影響較大，可能與芒果苷的游離形式和成鹽有關，芒果苷的酚羥基具有一定的酸性，可與堿成鹽，溶解性大大提高[15]。

Soluplus分散在水中時，可自我聚集形成膠束，膠束的核心是由聚乙烯己內酰胺和聚乙酸乙烯酯組成的疏水段，而由聚乙二醇組成的親水段則延伸至水相。本實驗結果顯示，當在Soluplus膠束中加入芒果苷誘導初始過飽和時，游離藥物分子緩慢擴散到疏水性膠束核，使疏水性藥物芒果苷溶解增加。當在Soluplus膠束中加入RH40后，芒果苷的溶解度可進一步增加，這可能是由于分子間相互作用強烈，單純的Soluplus膠束可能非常堅硬，藥物分子不易擴散至Soluplus膠束的疏水空間。當RH40加入到水溶液中，隨著濃度的增加，RH40持續(xù)擴散到疏水的膠束芯中，吸附在疏水的片段上形成小團簇，直到兩親性聚合物達到飽和，使Soluplus膠束崩解形成RH40-Soluplus絡合物，增加膠束的柔軟性，使芒果苷較易擴散至膠束內核而增加溶解度[11]。

本實驗建立了芒果苷準確可靠的分析方法，研究了不同輔料對芒果苷的增溶效果，為進一步研究芒果苷-Soluplus-RH40聚合物膠束奠定了基礎。