張瑜 王斌 牛記者 董丹丹 王蓮芳 毛紅騫 郭柏坤 李崗

摘 要：利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中硝基咪唑類藥物殘留。采用乙腈（含體積分數(shù)0.2%甲酸）進行樣品提取，然后經(jīng)過Oasis Prime HLB固相萃取小柱凈化處理，目標(biāo)物在液相系統(tǒng)進行洗脫分離，并使用質(zhì)譜電噴霧電離源正離子掃描模式進行檢測。結(jié)果表明：在優(yōu)化所得色譜流動相條件下，4 種硝基咪唑類藥物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（1.0～15.0 ng/mL）線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)≥0.991;在0.25、0.50、2.50 μg/kg 3 個水平的加標(biāo)實驗中，回收率分別為79.4%～105.8%、88.4%～104.6%、88.6%～101.3%，相應(yīng)的標(biāo)準偏差分別為≤11.9%、≤4.8%、≤2.8%，表明該方法準確度和精密度良好，能夠滿足日?？焖贆z驗的需求;4 種硝基咪唑類藥物均有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中洛硝達唑的基質(zhì)效應(yīng)最明顯，且同一種物質(zhì)加標(biāo)水平越低，基質(zhì)效應(yīng)越明顯。

關(guān)鍵詞：雞肉;硝基咪唑類藥物;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;基質(zhì)效應(yīng)

Abstract： The objective of this study was to establish and optimize a quick method for the determination of nitroimidazole residues in chicken by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. The samples were extracted using 0.2% formic acid in acetonitrile， and then the extract was purified using an Oasis Prime HLB solid phase extraction column. The mass spectrometer was operated using an electrospray ionization source in the positive ion mode. Under the optimal conditions， good linear relationships were obtained for four nitroimidazoles in the concentration range of 1.0–15.0 ng/mL， with correlation coefficients no less than 0.991. The recoveries at three spiked concentration levels of 0.25， 0.50 and 2.50 μg/kg were 79.4%–105.8%， 88.4%–104.6%， 88.6%–101.3%， respectively， with relative standard deviations （RSD） equal to or less than 11.9%， 4.8%， and 2.8%， respectively. The method had good accuracy and precision， could meet the requirements for rapid detection. This method had different matrix effects for all four nitroimidazoles. The matrix effect for ronidazole was more obvious than that for the other three nitroimidazoles. The lower the spiked concentration level， the more obvious of the matrix effect for each analyte.

Keywords： chicken; nitroimidazoles; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; matrix effect

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200811-195

中圖分類號：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0058-06

硝基咪唑類藥物在咪唑環(huán)的第5位上有一個-NO2基團[1-2]，該類化合物對某些由原生生物或厭氧細菌引起的疾病有治療作用，尤其是針對常見滴蟲病、寄生蟲感染及出血性疾病等[3-4]，該類藥物主要代表物質(zhì)有甲硝唑（metronidazole，MNZ）、地美硝唑（dimetridazole，DMZ）、羥基甲硝唑（hydroxymetronidazole，MNZOH）及洛硝噠唑（ronidazole，RNZ）等[5-7]。硝基咪唑類藥物具有“三致”性[1，8]，進入人體會造成不利影響。許多國家和地區(qū)已禁止在食源性動物中使用該類藥物[9]，我國對于該類藥物在動物養(yǎng)殖及動物源性食品生產(chǎn)過程中的應(yīng)用也進行了嚴格控制[10-12]，明確了MNZ、DMZ等獸藥不得在動物性食品中檢出[13]。

目前，國內(nèi)外研究中，硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物的檢測方法有氣相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15]、高效液相色譜法[16-17]、酶聯(lián)免疫吸附法[18]、毛細管電泳法[19]、生物傳感器法[20]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-23]等。

近年來在藥物殘留檢測領(lǐng)域，各檢測方法均有一定的優(yōu)缺點，如氣相色譜法具備分離效率高、分析速率快、定量準確等優(yōu)點，但存在前處理較復(fù)雜且衍生后部分硝基咪唑因衍生產(chǎn)物相同而不能分離、定性能力較差等缺點[24];液相色譜法具備定量準確、分析速率快、分離效率高等優(yōu)點，但同樣存在定性能力不足等缺點[25-26];酶聯(lián)免疫吸附法具備特異性強、設(shè)備要求低等優(yōu)點，但存在定量誤差大、檢測效率低等問題[18，27];高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有較好的靈敏度和抗干擾性被廣泛應(yīng)用，也是我國現(xiàn)行動物源性食品中硝基咪唑類藥物的主要檢測方法[7，28-29]。本研究以雞肉為研究對象，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，在現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)基礎(chǔ)上，在前處理和實驗條件上嘗試創(chuàng)新，采用新型專用固相萃取小柱凈化技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的凝膠色譜和固相萃取，進一步簡化樣品前處理步驟，對比不同流動相體系下硝基咪唑類藥物的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)，優(yōu)化檢測流動相體系，建立雞肉中代表性硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法，同時分析4 種硝基咪唑類藥物代表物質(zhì)在3 種不同濃度下的基質(zhì)效應(yīng)，為日常檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MNZ（純度99.8%）、DMZ（純度99.4%）、MNZOH（純度98.2%）、RNZ（純度99.1%）標(biāo)準品 德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國默克公司;甲酸（色譜純） 美國Sigma公司;雞肉?農(nóng)貿(mào)市場;N-丙基乙二胺吸附劑、十八烷基鍵合硅膠吸附劑C18、無水硫酸鎂 上海安譜實驗科技股份有限公司;Oasis Prime HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30AD液相色譜儀 日本島津公司;API 4000+質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司;3-30K冷凍離心機 德國Sigma公司;MTN-2800W氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;ZMQSJ0001超純水器 美國Millipore公司;BS124S電子天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準溶液配制

通過純度折算，精確稱取各硝基咪唑類藥物標(biāo)準品，用甲醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度1 mg/mL的儲備母液，冷凍避光保存（低于-18 ℃，保存時間不超過12 個月）。用甲醇將各母液混合，稀釋成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的中間儲備液，冷藏保存（0～4 ℃，保存時間不超過6 個月）。使用前再稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準工作液。

1.3.2 樣品前處理

參考丁燕玲等[4]的方法稍作調(diào)整，準確稱取制備好的雞肉樣品5 g（精確至0.01 g）于潔凈離心管中，準確加入10 mL體積分數(shù)0.2%甲酸-乙腈溶液，10 000 r/min均質(zhì)1 min，用高速冷凍離心機在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，備用。

QuEChERS凈化組：取全部上清液，向其中加入QuEChERS試劑（N-丙基乙二胺吸附劑100 mg、十八烷基鍵合硅膠吸附劑40 mg、無水硫酸鎂600 mg），渦旋混勻2 min，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液。

固相萃取小柱凈化組：取全部上清液，過Oasis Prime HLB固相萃取小柱，控制過柱后流速約為1 滴/s，收集流出液。

1.3.3 樣品凈化液的濃縮和定容

將上述流出凈化液在45 ℃條件下氮吹至近干，準確加入1 mL體積分數(shù)20%甲醇水溶液復(fù)溶。旋渦混勻1 min，然后靜置10 min，取上清液過聚醚砜水相針式濾膜（孔徑0.22 μm）后，待上機檢測。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動相A：一級純水（含體積分數(shù)0.1%甲酸）;流動相B1：甲醇（含體積分數(shù)0.1%甲酸）;流動相B2：乙腈（含體積分數(shù)0.1%甲酸）;柱溫40 ℃;進樣量5 μL;流速0.4 mL/min;梯度洗脫程序見表1。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離離子源;噴霧電壓5 500 V;霧化器壓力379 kPa;氣簾氣壓力172 kPa;輔助氣壓力379 kPa;離子源溫度550 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測模式。

經(jīng)優(yōu)化后4 種硝基咪唑類藥物的主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.3.5 結(jié)果計算

1.3.5.1 樣品中目標(biāo)物含量計算

樣品中目標(biāo)物殘留量按式（1）計算。

式中：X為樣品中目標(biāo)物殘留量/（μg/kg）;ρ為工作液中目標(biāo)物質(zhì)量濃度/（ng/mL）;V為樣液最終定容體積/mL;m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5.2 基質(zhì)效應(yīng)計算

基質(zhì)效應(yīng)按式（2）計算。

式中：A為經(jīng)過前處理的空白基質(zhì)中添加已知質(zhì)量濃度目標(biāo)物的響應(yīng)值;B為等質(zhì)量濃度目標(biāo)物純?nèi)芤旱捻憫?yīng)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜圖原始檢測數(shù)據(jù)由Analyst Software采集并導(dǎo)出，后續(xù)用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相體系的選擇

王蕊[30]研究蜂蜜中抗生素殘留檢測時發(fā)現(xiàn)，流動相中添加甲酸可有效防止拖尾。本研究為提高化合物的離子化效率，改善峰形和分離度，增強響應(yīng)信號，在流動相中添加體積分數(shù)0.1%甲酸。甲醇和乙腈是常用的有機流動相，由于2 種有機物在極性、強度、黏度等方面存在差異，對各物質(zhì)的分離能力也有區(qū)別。對比體積分數(shù)0.1%甲酸-甲醇溶液和體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液分別作為有機流動相體系時的分離效果，得到各物質(zhì)（5.0 ng/mL）

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