赫衛(wèi) 張慧

摘要 為建立規(guī)?；睦苯芬卟∶缙诳剐澡b定技術(shù)，將辣椒疫霉人工接種于抗疫病辣椒品種‘ICPN21-03和感病辣椒品種‘B16144，研究了接種菌液濃度、接種時(shí)期、病情調(diào)查時(shí)期和接種方法等對(duì)人工接種鑒定效果的影響。結(jié)果表明，接種菌液游動(dòng)孢子濃度為10個(gè)/mL時(shí)，感病品種病情指數(shù)為73.37，可以滿足寄主發(fā)病的需要;1 ～ 10真葉期接種均能使植株發(fā)病，但5 ～ 6真葉期接種能反映抗感病品種真實(shí)抗性;接種5 d調(diào)查抗感病品種病情指數(shù)分別為9.32和73.37，可明顯區(qū)別抗感病品種。使用浸根法進(jìn)行鑒定，需菌量小，對(duì)接種環(huán)境要求小。用37個(gè)辣椒品種進(jìn)行驗(yàn)證，鑒定結(jié)果表明該苗期抗性鑒定技術(shù)可很好地對(duì)辣椒品種進(jìn)行抗性水平分級(jí)鑒定。

關(guān)鍵詞 辣椒; 疫病; 抗性鑒定

中圖分類號(hào)： S 436.418.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019520

Abstract In order to develop a technique for large-scale assessment of the resistance of pepper materials to Phytophthora blight by using artificial inoculation with Phytophthora capsici， the parameters of the inoculation system including levels of inocula， growth stage of seedlings， investigation time and inoculation methods were studied by using ‘ICPN21-03 （resistant to blight） and ‘B16144 （susceptible to blight） in the laboratory. The results showed that the actual levels of plant resistance could be identified at 10 zoospores/mL， in which the disease index of ‘B16144 was 73.37. The true resistance of the varieties could be identified in the seedlings at 5-6-leaf stage， while it could cause Phytophthora blight from 1-leaf to 10-leaf stages. The disease indices of ‘ICPN21-03 and ‘B16144 were 9.32 and 73.37， respectively， 5th day of inoculation， which clearly distinguished between the resistant and susceptible varieties. The efficiency of inoculation by using root-soaking method was well， in which the inoculum concentration and the requirements for inoculation environment were low. The technique was verified by inoculation of 37 pepper varieties. The results suggest that the established assessment system is able to identify the level of plant resistance to P.capsici in pepper seedlings.

Key words pepper; Phytophthora capsici; resistance identification

辣椒是全球第一大蔬菜，疫病是辣椒的主要病害，是由疫霉Phytophthora capsici L.引起的毀滅性真菌病害。控制疫病有多種方式，可以利用分子生物學(xué)尋找致病相關(guān)基因，如SDA1[1]、CaSBP12[2]等。也可以利用化學(xué)藥劑防治，如Tian等[3]合成了16種麥芽酚磺酸鹽衍生物，并分別在體外測(cè)定了它們對(duì)辣椒疫霉的抗菌活性。Wang等[4]對(duì)菜籽粕的生物熏蒸和棉隆的化學(xué)熏蒸進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)生物熏蒸通過(guò)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)降低了辣椒疫病的發(fā)病率。選育和利用抗病品種是防治辣椒疫病最直接、安全、高效的措施之一，有著減少農(nóng)藥使用，減少對(duì)空氣、水和土壤的污染，降低農(nóng)殘等優(yōu)點(diǎn)。篩選抗病種質(zhì)資源一直是抗病育種的重要基礎(chǔ)工作。灌根法是目前最常用的辣椒疫病鑒定方法。譚清群等[5]對(duì)24份貴州省辣椒新品種、關(guān)天舒等[6]對(duì)國(guó)內(nèi)外217份辣椒材料分別采用灌根法鑒定其對(duì)疫病的抗性。或者采用果實(shí)鑒定法，Naegele等[7]使用果實(shí)接種鑒定了來(lái)自五大洲45個(gè)國(guó)家的170種辣椒基因型的疫病抗性。研究人員也在嘗試采用分子手段鑒定辣椒品種的疫病抗性。Liu等[8]找到標(biāo)記Phyto5NBS1，可用于鑒定疫病抗性相關(guān)的5號(hào)染色體上主要QTL。Yu等[9]開(kāi)發(fā)了一種基于側(cè)流層析試紙條的重組酶聚合酶擴(kuò)增（LF-RPA）的新型檢測(cè)方法，用于快速，無(wú)設(shè)備檢測(cè)辣椒疫霉。本文介紹了一種浸根法，其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便易行、需菌量小、無(wú)接種環(huán)境要求、真實(shí)反映系統(tǒng)抗性等，是大規(guī)模接種鑒定辣椒疫病的可行方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒抗病品種‘ICPN21-03和感病品種‘B16144，以及人工接種鑒定所用35份辣椒材料，均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院提供。辣椒播種前進(jìn)行種子消毒處理，用52～55℃的溫水浸種30 min，10%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，清水沖洗后浸種催芽，播種于育苗缽內(nèi)。育苗基質(zhì)為蛭石∶草炭∶土壤=1∶2∶1，134℃ 滅菌30 min后備用。

1.2 疫霉培養(yǎng)

將辣椒疫霉菌種接種在燕麥固體培養(yǎng)基上，在25～28℃暗培養(yǎng)7 d，然后在25～28℃，L∥D=16 h∥8 h培養(yǎng)7 d誘發(fā)孢子囊。用無(wú)菌水沖洗菌體獲得懸浮液，懸浮液4℃放置30 min，孢子囊破裂，釋放游動(dòng)孢子，在顯微鏡100倍物鏡下觀察，有透明的游動(dòng)孢子釋放出來(lái)即可用于接種。

1.3 接種

采用浸根法接種。辣椒苗根部用無(wú)菌水沖洗干凈，然后用吸水紙拭去表面的水分。50 mL錐形瓶?jī)?nèi)加入菌液30 mL，每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)插入6株苗，置于溫度28℃光照16 h，25℃黑暗8 h的植物培養(yǎng)箱內(nèi)，在侵染期間錐形瓶?jī)?nèi)水缺少時(shí)，補(bǔ)充無(wú)菌水。每個(gè)處理30株苗以上，3次重復(fù)，以水處理為對(duì)照。

接菌濃度篩選：接菌液游動(dòng)孢子濃度分別為10、30、100、300、1 000個(gè)/mL。在5～6片真葉期接種，接種5 d調(diào)查病情。

接種時(shí)期篩選：分別在辣椒1～2、3～4、5～6、7～8、9～10片真葉期采用浸根法接種。接菌液游動(dòng)孢子濃度為10個(gè)/mL，接種5 d調(diào)查病情。

調(diào)查時(shí)間篩選：分別浸根3、5、7、9 d調(diào)查病情。接種時(shí)期為5～6片真葉期，接菌游動(dòng)孢子濃度為10個(gè)/mL。

不同接種方法比較：灌根接種法參考譚清群等[5]的方法，接種后第7 天第1次調(diào)查，接種后第14 天第2次調(diào)查。果實(shí)接種法參考赫衛(wèi)等[10]的方法，接種后第3 天第1次調(diào)查，接種后第5 天第2次調(diào)查。

1.4 調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

幼苗病情級(jí)別分為6級(jí)（圖1），其相應(yīng)的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無(wú)癥狀;1級(jí)，幼苗根莖部輕微水浸狀病斑，葉片不萎蔫或可恢復(fù)性萎蔫;2級(jí)，幼苗根莖部水浸狀病斑直徑2～3 cm，葉片不可恢復(fù)性萎蔫，下部葉片偶有脫落;3級(jí)，幼苗根莖部水浸狀病斑直徑超過(guò)3 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯;4級(jí)，幼苗根莖部水浸狀病斑大面積蔓延，除生長(zhǎng)點(diǎn)外全部落葉或植株萎蔫;5級(jí)，植株枯死。

疫病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I），病情指數(shù)=0;高抗（HR），0<病情指數(shù)≤10;抗?。≧），10<病情指數(shù)≤30;中抗（MR），30<病情指數(shù)≤50;感?。⊿），50<病情指數(shù)≤70;高感（HS），病情指數(shù)>70。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌濃度的選擇

辣椒苗期疫病發(fā)病率及病情指數(shù)隨著接種菌液濃度的增大而顯著升高（表1，圖2）。在較高接種菌液游動(dòng)孢子濃度為1 000、300個(gè)/mL和100個(gè)/mL時(shí)，抗病品種的病情指數(shù)分別為76.15、51.98和3594，發(fā)病過(guò)重，抗性材料變?yōu)楦胁』蛑锌?，不能真?shí)反映品種的抗性水平。感病品種病情指數(shù)在3個(gè)濃度下無(wú)顯著差異，發(fā)病均很重。在接種菌液游動(dòng)孢子濃度為30個(gè)/mL或10個(gè)/mL時(shí)，抗病品種的病情指數(shù)分別為16.11和9.32，感病品種的病情指數(shù)分別為8385和73.37，能夠真實(shí)反映材料本身的抗病性，且抗病品種與感病品種的病情指數(shù)差異顯著，能明顯區(qū)分抗感品種，而接種菌液游動(dòng)孢子濃度在10個(gè)/mL時(shí)，用菌量更少。因此在苗期人工接種鑒定中，適宜的接種菌液游動(dòng)孢子濃度確定為10個(gè)/mL。

2.2 接種寄主苗齡對(duì)鑒定效果的影響

接種寄主的苗齡對(duì)疫病接種效果影響較大（表2，圖2），隨著苗齡的增長(zhǎng)，植株的抗病力增強(qiáng)，發(fā)病延遲。1～2、3～4、5～6、7～8、9～10片真葉期接種的病情指數(shù)差異顯著;其中5～6片真葉期接種的抗感病品種的病情指數(shù)分別為9.32和73.37，病情指數(shù)大小適中，真實(shí)反映了材料本身的抗病性。1～2片真葉期接種的抗感病品種明顯萎蔫或枯死，其對(duì)照水處理出現(xiàn)莖基部腐爛的癥狀，干擾了病情指數(shù)調(diào)查。出現(xiàn)這種情況可能是苗齡過(guò)小，莖基部沒(méi)有木質(zhì)化，經(jīng)受不住多天的液體浸泡。1～2、3～4片真葉期接種的抗病品種的病情指數(shù)分別為59.93和3060，7～8、9～10片真葉期接種的感病品種病情指數(shù)分別為61.06和4629，不能反映材料的真實(shí)抗性水平。在7～8、9～10片真葉期，苗齡過(guò)大，植株抵抗病害的能力較強(qiáng)，侵染進(jìn)程和發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)。此外，9～10片真葉期苗齡過(guò)大，有向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。因此最佳接種苗齡為5～6片真葉期。

2.3 病情調(diào)查時(shí)期的選擇

試驗(yàn)結(jié)果表明，在游動(dòng)孢子懸浮液濃度10個(gè)/mL處理下，辣椒幼苗疫病發(fā)病率及病情指數(shù)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，各處理間差異顯著（表3，圖2）。接種3 d后，感病品種葉片多為可恢復(fù)性萎蔫，病情指數(shù)為27.76，發(fā)病太輕，不能真實(shí)地反映品種的抗性水平。接種7 d后，抗病品種的植株為可恢復(fù)性或不可恢復(fù)性萎蔫，病情指數(shù)為31.84，感病品種的植株呈明顯萎蔫或枯死的狀態(tài)，發(fā)病重，不能真實(shí)反映品種的抗性水平。接種9 d后，抗感病品種都表現(xiàn)為明顯萎蔫或枯死，發(fā)病過(guò)重。接種5 d后，不萎蔫、可恢復(fù)性萎蔫、不可恢復(fù)性萎蔫、落葉明顯、枯死的植株并存，抗病品種與感病品種的病情指數(shù)分別為9.32和73.37，差異顯著，易區(qū)分抗感品種，能真實(shí)地反映品種的抗性水平。因此適宜的病情調(diào)查時(shí)期為接種第5天。

2.4 不同接種方法的比較

采用3種方法接種均可以有效區(qū)分抗感病品種，抗病品種‘ICPN21-03和感病品種‘B16144的病情指數(shù)差異顯著（表4）。比較3種接種方法，發(fā)病最快且嚴(yán)重的為果實(shí)接種法，接種第3天即表現(xiàn)為菌絲擴(kuò)散，出現(xiàn)水浸狀病斑，抗病品種‘ICPN21-03的病情指數(shù)為19.70，顯著高于浸根法的9.32（5 d）和灌根法的8.21（7 d）。

果實(shí)接種法發(fā)病重于其他兩種方法。第一次調(diào)查時(shí)，浸根法（5 d）的抗病品種和感病品種的病情指數(shù)分別與灌根法（7 d）無(wú)顯著差異，與鑒定寄主抗感情況一致，但抗、感病品種的發(fā)病率（40.76%和100%）顯著高于灌根法（22.82%和84.38%），發(fā)病整齊度更好。第二次調(diào)查時(shí)，浸根法（7 d）的抗病品種的病情指數(shù)顯著高于灌根法（14 d）。說(shuō)明浸根法可用于疫病鑒定，具有發(fā)病快、發(fā)病整齊的特點(diǎn)。

2.5 辣椒種質(zhì)資源的抗病性鑒定

采用浸根法對(duì)辣椒品種的疫病抗性進(jìn)行分級(jí)，不同品種呈現(xiàn)抗性明顯不同。根據(jù)病情指數(shù)與抗病性的關(guān)系對(duì)37個(gè)品種進(jìn)行鑒定（表5），其中鑒定為高抗（HR）的僅2個(gè)品種，抗?。≧）品種11個(gè)，中抗（MR）品種6個(gè)，感?。⊿）品種12個(gè)，高感品種（HS）6個(gè)。說(shuō)明采用浸根法可以將不同辣椒品種進(jìn)行很好的抗性水平分級(jí)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)建立了一種適合辣椒疫病的苗期抗性鑒定方法，即在苗齡為5～6片真葉期時(shí)采用浸根法接種，接種游動(dòng)孢子懸浮液濃度為10個(gè)/mL，接種5 d后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。利用辣椒品種對(duì)建立的鑒定方法進(jìn)行了驗(yàn)證，該苗期抗性鑒定方法可很好地對(duì)辣椒品種進(jìn)行抗性水平分級(jí)鑒定，表明該方法可用于辣椒抗性材料的篩選。本研究采用6級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，與灌根法采用的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)大體一致。灌根法在接種試驗(yàn)中應(yīng)用比較多，但該方法接種菌液濃度高，對(duì)菌液的需求量大，而研究者采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)疫霉[5-6]，疫霉大量擴(kuò)繁困難，工作量大。本研究通過(guò)不同菌液濃度對(duì)辣椒疫病抗性鑒定的影響試驗(yàn)，證明游動(dòng)孢子懸浮液僅僅10個(gè)/mL的濃度就可以達(dá)到辣椒疫病浸根法接種的濃度需求，能夠真實(shí)反映辣椒幼苗本身的抗性，與灌根法接種疫霉游動(dòng)孢子濃度1 000個(gè)/mL相比，菌濃度大大降低，不需要大量擴(kuò)繁疫霉。浸根法接種寄主苗齡為5～6片真葉期，與灌根法的第6片真葉展平期相近。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒1～10葉期接種均能發(fā)病，但接種苗齡越大，植株本身的抗病性越強(qiáng)，疫病發(fā)生時(shí)間也隨之推遲。果實(shí)接種法是離體接種，要求嚴(yán)格控制濕度，灌根法在接種期間要適時(shí)澆水，保持土壤濕度近飽和狀態(tài)。浸根法根部直接暴露在菌液中，沒(méi)有土壤環(huán)境的干擾，利于發(fā)病，且不需要控制濕度。與灌根法和果實(shí)接種法相比，本研究建立的接種方法具有菌需求量小，需求空間小，對(duì)接種環(huán)境要求小，鑒定時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適于大批量種質(zhì)資源的篩選。本研究可為辣椒抗病育種工作提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）