王靖怡，高嘉良，王 階

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院 北京 100053）

目前,病證結(jié)合是中醫(yī)臨床診療的重要模式，強(qiáng)調(diào)臨床診療過(guò)程中既重視西醫(yī)疾病的診斷，又注重中醫(yī)證候的認(rèn)識(shí)[1]。中醫(yī)藥要實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛越，與世界接軌，需要繼承發(fā)展、守正創(chuàng)新，在中醫(yī)藥理論內(nèi)涵、作用機(jī)制、療效評(píng)價(jià)及新藥研發(fā)等多個(gè)環(huán)節(jié)獲取有力佐證。在中國(guó)悠久的歷史長(zhǎng)河中，中醫(yī)藥臨床療效顯著有目共睹，但如何從基礎(chǔ)研究對(duì)其有效性進(jìn)行驗(yàn)證仍是亟需攻克的關(guān)鍵難題。有鑒于此，研究者將目光轉(zhuǎn)向病證結(jié)合動(dòng)物模型這個(gè)重要載體，其也日益成為中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究熱點(diǎn)而廣受關(guān)注，故本文對(duì)目前病證結(jié)合動(dòng)物模型研究概況進(jìn)行了簡(jiǎn)要梳理。

1 病證結(jié)合動(dòng)物模型是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵

西醫(yī)學(xué)之“病”以西醫(yī)理論體系為基礎(chǔ)，聚焦人體細(xì)胞、組織、器官等結(jié)構(gòu)與功能方面的病理變化，從全程和特征上認(rèn)識(shí)疾病本質(zhì)[2]，并以此為治療依據(jù)[3]?！白C”是中醫(yī)學(xué)特有的概念，作為疾病的“橫斷面”，反映疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中某一階段的病理本質(zhì)，涵蓋病因、病位、病性、病機(jī)、病勢(shì)及虛實(shí)邪正等方面內(nèi)容，強(qiáng)調(diào)與疾病相關(guān)的各種因素共同作用于機(jī)體所體現(xiàn)的整體反應(yīng)特性[3]?！安　薄白C”結(jié)合臨床診療及科研模式是中西醫(yī)學(xué)兩種體系的結(jié)合，旨在融合疾病與證候體系，研究疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，便于指導(dǎo)臨床防治疾病[4]，其優(yōu)越性早在朱肱的《南陽(yáng)活人書(shū)》中就有所提及：“因名識(shí)病，因病識(shí)證，如暗得明，胸中曉然，無(wú)復(fù)疑慮而處病不差矣?！?/p>

證候是中醫(yī)學(xué)的理論核心，辨證論治是臨床治療的基礎(chǔ)。證候不僅是對(duì)臨床現(xiàn)象的歸納總結(jié)，更是聯(lián)系中醫(yī)理論與臨床實(shí)踐的關(guān)鍵樞紐。“有諸內(nèi)必形諸于外”，證候的外在表現(xiàn)為四診宏觀信息所體現(xiàn)的具有規(guī)律性的病理生理過(guò)程，而其內(nèi)在規(guī)律性的物質(zhì)基礎(chǔ)尚待進(jìn)一步挖掘[5]。證候?qū)嵸|(zhì)的揭示不僅能夠促進(jìn)辨證論治的客觀化與科學(xué)化，更是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，與世界接軌的必經(jīng)之路，而病證結(jié)合正是證候本質(zhì)研究的關(guān)鍵手段之一。在探尋證候?qū)嵸|(zhì)和深化機(jī)制認(rèn)識(shí)等方面，動(dòng)物模型都是重要的工具和手段[6]。病證結(jié)合動(dòng)物模型的建立旨在探索病理生理變化與證候特征之間的關(guān)聯(lián)，從基礎(chǔ)研究的角度為中醫(yī)藥療效發(fā)聲，提供客觀有力的支持與依據(jù)，在中藥篩選、機(jī)制研究、新藥開(kāi)發(fā)乃至中西醫(yī)理論深層次的探討等方面都具有重要意義[7]。

2 病證結(jié)合動(dòng)物模型在研制思路上不斷創(chuàng)新

自20 世紀(jì)60 年代鄺安堃制備出首例中醫(yī)陽(yáng)虛動(dòng)物模型以來(lái)[8]，至今已有上百種證候動(dòng)物模型建立[9]。單純的中醫(yī)證候造模多從病因入手，將中醫(yī)認(rèn)為造成“證候”形成的原因施加于動(dòng)物，以求造成與患者表現(xiàn)相同或相似的“證候”。然而，單純的中醫(yī)病因?qū)τ谥嗅t(yī)病證來(lái)說(shuō)多為誘發(fā)因素，而非直接發(fā)病因素，往往不具備特異性，與個(gè)體敏感程度、施加強(qiáng)度及作用時(shí)間等密切相關(guān)，因此模型的穩(wěn)定性和代表性相對(duì)薄弱。西醫(yī)常規(guī)動(dòng)物造模基于明確且特異的病理?yè)p害，其穩(wěn)定性高、可重復(fù)性好，方法較為成熟，但缺乏中醫(yī)辨證思想，模型動(dòng)物的病理狀態(tài)往往較難與中醫(yī)特定證候?qū)Φ萚10]。結(jié)合二者各自的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)，病證結(jié)合造模方法應(yīng)運(yùn)而生，其在研制思路上不斷進(jìn)行創(chuàng)新與融合，具體如下文。

2.1 中西醫(yī)結(jié)合多因素復(fù)合造模

以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)相關(guān)知識(shí)，分別或同時(shí)采用中醫(yī)病因病機(jī)（如六淫、飲食、勞倦、情志等）復(fù)制證候模型，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制疾病動(dòng)物模型，使模型動(dòng)物同時(shí)兼?zhèn)浼膊『妥C候的特征[11]。有研究[12]通過(guò)高糖高脂飼喂聯(lián)合游泳致力竭模擬中醫(yī)病因，聯(lián)合腹腔注射丁胺卡那霉素和鏈脲佐菌素模擬西醫(yī)病因，使模型大鼠符合2 型糖尿病脾腎氣虛證病證結(jié)合動(dòng)物模型的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。由于該模型可有效模擬臨床疾病與證候之間的病理對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此已廣泛作為研究載體進(jìn)行臨床病理及證候本質(zhì)的研究，并逐漸成為中藥新藥判定客觀療效和探討藥理作用的重要手段[13]。亦有學(xué)者[14]利用高脂飼養(yǎng)聯(lián)合冰柜冷藏，結(jié)合皮下注射腦垂體后葉素（pit），建立冠心病陽(yáng)虛血瘀證大鼠模型，通過(guò)觀察動(dòng)物整體活動(dòng)表現(xiàn)及血脂、心肌酶、心電圖、心臟彩超等檢查，以及溫陽(yáng)活血藥物干預(yù)進(jìn)行反證，多環(huán)節(jié)論證模型與臨床的一致性。

2.2 西醫(yī)疾病模型基礎(chǔ)上探尋中醫(yī)證候

病與證候不可完全割裂看待，證候并非游離于疾病之外，也非施加中醫(yī)病因才出現(xiàn)中醫(yī)證候，而是在疾病發(fā)展過(guò)程中同時(shí)存在中醫(yī)證候的變化[15]。該模型是在西醫(yī)疾病模型的基礎(chǔ)上，未施加任何其他外在人為干預(yù)因素，在成模過(guò)程中或成模后，宏觀、微觀相結(jié)合，動(dòng)態(tài)觀察并采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癥狀、體征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，綜合分析并歸納疾病形成過(guò)程中“證候”的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程、特點(diǎn)，以及成模后所表現(xiàn)的中醫(yī)證型，從而確定某一特定的病證結(jié)合模型。有研究者[16]應(yīng)用免疫造模法模擬人類(lèi)免疫性血小板減少性紫癜，結(jié)果顯示模型符合由急性發(fā)病的熱證轉(zhuǎn)化為慢性發(fā)病的氣虛血瘀證的臨床實(shí)際情況。亦有相關(guān)研究[17]通過(guò)對(duì)自發(fā)性高血壓模型大鼠（SHR）早期中醫(yī)證候?qū)傩赃M(jìn)行行為學(xué)研究及宏觀表征觀察，發(fā)現(xiàn)SHR 早期中醫(yī)證候與人類(lèi)高血壓肝火上炎證相似。還有研究[18]采用夾尾、禁食水、冰水強(qiáng)迫游泳、噪音刺激、限制行為等多種刺激類(lèi)型，隨機(jī)安排建立抑郁癥大鼠模型，根據(jù)大鼠表征和行為學(xué)檢測(cè)判定為肝郁脾虛證型。

2.3 證候模型基礎(chǔ)上探尋西醫(yī)疾病類(lèi)型

該模型建立首先依靠中醫(yī)傳統(tǒng)病因造模方式對(duì)動(dòng)物進(jìn)行初步環(huán)境因素模擬，通過(guò)觀察宏觀表征、檢測(cè)理化指標(biāo)以及代表性方藥反證等方式，初步確立證候動(dòng)物模型，在此前提下，尋找具有關(guān)聯(lián)性的臨床疾病進(jìn)行驗(yàn)證[19]。有研究[20]采用大黃煎煮液灌胃聯(lián)合夾尾、番瀉葉煎煮液聯(lián)合束縛的方法建立肝郁脾虛證候大鼠模型，通過(guò)比較大鼠造模前后體質(zhì)量變化、給藥后排稀便時(shí)間等來(lái)評(píng)價(jià)該模型是否與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的腸易激綜合征表現(xiàn)一致。

3 規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題仍面臨巨大挑戰(zhàn)

3.1 從多因素著手建立規(guī)范化病證結(jié)合動(dòng)物模型

選擇何種動(dòng)物進(jìn)行人體病證的延伸模擬，是實(shí)驗(yàn)研究的首要步驟。任何實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都是研究過(guò)程中不可缺少的“最精密的實(shí)驗(yàn)儀器”[21]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與模型的制備關(guān)系密切，因此在制備過(guò)程中應(yīng)盡量選擇與人體相似度高，對(duì)造模因素敏感性高，模型特征出現(xiàn)迅速、穩(wěn)定且持久，同時(shí)易于滿足所研究病證相應(yīng)特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[22]，以便于更好地模擬復(fù)制人類(lèi)病證。例如，小型豬循環(huán)系統(tǒng)與人類(lèi)相似，適宜于復(fù)制心血管相關(guān)病證[23-24]；大鼠及小鼠因易獲取、低成本、相關(guān)研究多、研究者熟悉程度高等因素，成為目前較為常用的造模動(dòng)物。另外，同一證候模型造模動(dòng)物選擇差異較大，如脾虛證模型制備選取動(dòng)物有大鼠、小鼠、豚鼠等[25]。由于不同品系、不同性別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)造模因素的耐受及敏感程度不同，同等強(qiáng)度作用于不同種系、不同生長(zhǎng)階段的動(dòng)物所造成的效果也不盡相同。這是模型可復(fù)制性相對(duì)較差的主要原因之一。因此，在縱向進(jìn)行同一病證造模的同時(shí)，運(yùn)用比較醫(yī)學(xué)的思想，橫向探索不同種系動(dòng)物模型之間的相似度與差異性，從而篩選建立不同病證結(jié)合模型最適宜的造模動(dòng)物選取標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行相關(guān)病證結(jié)合動(dòng)物模型系統(tǒng)評(píng)價(jià)時(shí)，可借鑒采用GRADE 對(duì)證據(jù)體進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)，有利于提高臨床實(shí)踐與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證的可行性[26]。

此外，病證結(jié)合動(dòng)物模型并非憑空想象組合，所要構(gòu)建的病證模型需在臨床上確有關(guān)聯(lián)，具有發(fā)展階段的同步性，同時(shí)需要滿足兩者的結(jié)合點(diǎn)易于發(fā)現(xiàn)，這樣才有可能作為深入探討病證結(jié)合機(jī)制的切入點(diǎn)進(jìn)行研究，如臨床已證實(shí)冠心病與血瘀證的關(guān)系密切等。

造模因素的選擇對(duì)于構(gòu)建規(guī)范化的病證結(jié)合動(dòng)物模型也至關(guān)重要。目前，病證結(jié)合動(dòng)物模型存在的主要問(wèn)題是同一證候存在多種造模方法，如脾虛證模型造模因素中，中醫(yī)病因造模就包括苦寒瀉下、飲食失節(jié)、限制營(yíng)養(yǎng)、耗氣等，若聯(lián)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法，采取單因素或復(fù)合因素方式構(gòu)建，則種類(lèi)更多，據(jù)統(tǒng)計(jì)可多達(dá)24 種[27]。目前尚缺乏何種造模因素能造出典型的符合臨床實(shí)際的中醫(yī)證型的相應(yīng)規(guī)范。有鑒于此，可以結(jié)合臨床導(dǎo)致證候出現(xiàn)的主次原因，適當(dāng)優(yōu)化造模因素，使其同時(shí)符合中醫(yī)發(fā)病規(guī)律和臨床發(fā)病實(shí)際進(jìn)程。同時(shí)，還可對(duì)同一證型的多種造模方法進(jìn)行橫向比較，篩選建立最佳的構(gòu)建模型的造模因素。

3.2 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)體系至關(guān)重要

模型動(dòng)物造模成功與否關(guān)鍵取決于對(duì)模型的評(píng)價(jià)。目前大多數(shù)病證結(jié)合動(dòng)物模型缺乏合理的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系和方法?；谶@種現(xiàn)狀，可以考慮從以下兩方面入手。

第一，宏觀表征與微觀指標(biāo)對(duì)接，構(gòu)建人與動(dòng)物四診轉(zhuǎn)換模式。由于人與動(dòng)物在解剖結(jié)構(gòu)、生理病理等方面都存在一定的差異，因此證候轉(zhuǎn)換的問(wèn)題不容忽視。一方面可以充分挖掘動(dòng)物自身有助診斷的癥狀信息特點(diǎn)，尋找其與人的相似性，便于辨證分析；另一方面可以基于理論及臨床研究，總結(jié)一切能夠具體反映“證候”特點(diǎn)的生物標(biāo)志物或宏觀表征，有機(jī)對(duì)接嵌構(gòu)于動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系中。目前已有相關(guān)研究在大鼠、小鼠和小型豬四診信息（半）客觀化方面取得一定的進(jìn)展，如大鼠、小鼠四診工作站的建立可以實(shí)現(xiàn)定量化、標(biāo)準(zhǔn)化的采集和評(píng)價(jià)[28]。

第二，結(jié)合有效經(jīng)典方藥反向驗(yàn)證。利用方證相應(yīng)理論，逆向應(yīng)用“有是證用是方”治療思路進(jìn)行反向驗(yàn)證，通過(guò)用藥后癥狀、體征及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的改善來(lái)證明模型動(dòng)物的證候?qū)傩?。這可以進(jìn)一步說(shuō)明病證結(jié)合模型的科學(xué)性和合理性。

4 多學(xué)科交叉與大數(shù)據(jù)興起或?qū)?lái)機(jī)遇

4.1 從系統(tǒng)生物學(xué)尋找模型標(biāo)志網(wǎng)絡(luò)

系統(tǒng)生物學(xué)是當(dāng)前研究生命復(fù)雜系統(tǒng)較為公認(rèn)的思維方式和研究手段，有利于揭示中醫(yī)證候的非線性復(fù)雜巨系統(tǒng)[29]。系統(tǒng)生物學(xué)通過(guò)整合多種組學(xué)信息，研究一個(gè)生物系統(tǒng)中的所有組分（如基因、mRNA、蛋白質(zhì)及代謝物等）在特定條件下（如遺傳、環(huán)境因素改變等）的相互關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)從微觀基因、細(xì)胞、組織到宏觀個(gè)體的多方向、多層次研究，以解析生命復(fù)雜過(guò)程的本質(zhì)規(guī)律[30-31]。系統(tǒng)生物學(xué)整合思想觀念與中醫(yī)“整體觀念”和“辨證論治”核心不謀而合，將其應(yīng)用于探尋證候本質(zhì)的研究，有可能從完整的疾病分子角度去詮釋證候的核心，幫助我們更好地理解證候?qū)嵸|(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)證候理論客觀化、定量化的科學(xué)詮釋?zhuān)@也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國(guó)際化發(fā)展的重要路徑。

單一組學(xué)在中醫(yī)證候研究領(lǐng)域的應(yīng)用已較為廣泛，但仍需明確的是，組學(xué)本身并不能等同于系統(tǒng)生物學(xué)，而是要以系統(tǒng)模型為指向，結(jié)合生物信息學(xué)、系統(tǒng)控制等方法，針對(duì)證候的“外延”與“內(nèi)涵”通過(guò)計(jì)算模型獲得規(guī)律性認(rèn)識(shí)，從而產(chǎn)生與試驗(yàn)結(jié)果相一致的系統(tǒng)模型[32]，否則單純的組學(xué)只不過(guò)是大規(guī)模的還原分析[33]。目前，已有相關(guān)中醫(yī)證候的網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建研究，如Li S 等[34]采用文獻(xiàn)挖掘、網(wǎng)絡(luò)分析及拓?fù)浔容^等方法，采用“相互作用-網(wǎng)絡(luò)-功能”研究策略，構(gòu)建出基于“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡(luò)相互作用下的中醫(yī)寒熱證網(wǎng)絡(luò)模型。這些網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建可以有機(jī)建立起從人轉(zhuǎn)向動(dòng)物模擬的生物學(xué)標(biāo)志,為關(guān)鍵病理調(diào)控節(jié)點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供線索，也為病證結(jié)合動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建做出貢獻(xiàn)。

表型組學(xué)（phenomics）[35]概念的提出也為證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供了新視角，幫助識(shí)別判斷證候所依賴的主觀癥狀的生物學(xué)基礎(chǔ)。這些研究將有助于科研工作者整體、全面地印證中醫(yī)證候動(dòng)物模型的有效性及科學(xué)性，推進(jìn)中醫(yī)理論的探索研究，深入“證候”本質(zhì)[36]，在證候與生物學(xué)指標(biāo)之間有機(jī)構(gòu)建相對(duì)穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)，有助于闡明中醫(yī)證候與疾病的生物學(xué)關(guān)系。

4.2 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)交叉助力模型構(gòu)建

有學(xué)者[37]提出，潛變量分析可以在分析過(guò)程中引入無(wú)法直接觀察、需經(jīng)測(cè)量推斷的指標(biāo)或變量，這與中醫(yī)證候的特點(diǎn)具有某些相似之處，因此有學(xué)者通過(guò)潛變量分析作為病證結(jié)合動(dòng)物模型構(gòu)建思路進(jìn)行相關(guān)研究[38]。此外，Swanson教授提出一種基于非相關(guān)文獻(xiàn)知識(shí)發(fā)現(xiàn)的方法，可通過(guò)尋找隱藏關(guān)聯(lián)用于知識(shí)發(fā)現(xiàn)[39]。該方法可應(yīng)用于兩類(lèi)不相關(guān)的疾病文獻(xiàn)中尋找可能的相關(guān)因素，這與中醫(yī)“異病同治”思想存在一定的關(guān)聯(lián)。該方法可以應(yīng)用于“方證相應(yīng)”理論研究，挖掘同一方劑主治疾病譜存在的共同病理環(huán)節(jié)，并據(jù)此選擇典型的病因進(jìn)行造模，使關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)所致典型臨床特征得以在動(dòng)物模型上實(shí)現(xiàn)。此外，貝葉斯網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和卡方自動(dòng)交互檢測(cè)決策樹(shù)、決策函數(shù)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等信息挖掘及人工智能手段也為更好地建立病證結(jié)合生物信息網(wǎng)絡(luò)，輔助動(dòng)物模型的構(gòu)建提供支持。

5 結(jié)語(yǔ)

盡管在病證結(jié)合動(dòng)物模型領(lǐng)域已有諸多創(chuàng)新，并取得了一定的成果，但仍有許多問(wèn)題尚待解決。尤其是規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題，有賴于革新的技術(shù)手段和前沿的科學(xué)知識(shí)等諸多條件。因此，科研工作者要擺脫“一次成型”的思想。模型不能完全等同原型，只要能夠?qū)崿F(xiàn)模擬原型實(shí)質(zhì)并反映研究目的就是適合的模型，因此，在研制觀念上不應(yīng)苛求每個(gè)模型都精準(zhǔn)、全面、系統(tǒng)地覆蓋和表達(dá)臨床病例實(shí)體原型，畢竟病證在人體的表現(xiàn)形式也是千差萬(wàn)別的。在評(píng)價(jià)體系的建立和完善過(guò)程中也應(yīng)給予一定的時(shí)間，任何一種評(píng)價(jià)方法學(xué)的建立都需要在發(fā)展的過(guò)程中不斷去探索修正和改進(jìn)完善，絕不可能一蹴而就。盡管病證結(jié)合動(dòng)物模型之路道阻且長(zhǎng)，但新知識(shí)、新技術(shù)的高速革新與更迭，一定能夠?yàn)槠渥⑷胄碌纳鷻C(jī)和活力，更有效地助力證候乃是中醫(yī)藥療效實(shí)質(zhì)的揭示。