袁敏　錢(qián)世權(quán)　曹慧　徐斐　葉泰　于勁松　郭文　吳嘉穎　阿提坎?吾斯曼

摘 要 設(shè)計(jì)了一種基于核酸適配體檢測(cè)鎘離子（Cd2+）的電化學(xué)生物傳感器， 將適配體互補(bǔ)鏈（CDNA）通過(guò)AuS鍵自組裝于金電極表面， 并與適配體雜交結(jié)合形成雙鏈DNA。由于適配體對(duì)Cd2+有特異性結(jié)合能力， 加入Cd2+后， 與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體， 使修飾二茂鐵基團(tuán)的適配體從金電極表面脫落， 二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)顯著減小。采用方波伏安法（SWV）進(jìn)行檢測(cè)， 本傳感器對(duì)Cd2+的線性檢測(cè)范圍為1.0 nmol/L～10.0 μmol/L， 檢出限為65.1 pmol/L， 線性方程為ΔI =0.2872+0.2327lgC（R2=0.9972）， 10 s內(nèi)即可完成檢測(cè)。實(shí)際江水樣品中Cd2+的檢測(cè)結(jié)果與石墨爐原子吸收光譜法的檢測(cè)結(jié)果一致， 加標(biāo)回收率為97.1%～99.5%。本方法靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)， 在鎘環(huán)境污染監(jiān)測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 鎘離子; 電化學(xué); 生物傳感器; 適配體; 二茂鐵

1 引 言

隨著工業(yè)化的發(fā)展， 重金屬污染日益嚴(yán)重， 一些難降解的重金屬在生物體內(nèi)累積會(huì)引發(fā)多種疾病[1]。鎘（Cd）在冶金、顏料、鎳鎘電池和軍工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2，3]， 進(jìn)入人體后， 可與蛋白質(zhì)結(jié)合， 抑制多種酶的活性， 從而影響機(jī)體的正常功能[4，5]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定， 飲用水中鎘的最高限量值為44.5 nmol/L[6]。因此， 建立一種高靈敏監(jiān)測(cè)環(huán)境和食品中鎘含量的方法具有重要意義[7，8]。

目前， 檢測(cè)鎘等重金屬離子的方法主要有原子吸收光譜法（AAS）[9，10]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）[11]及原子熒光光譜法（AFS）[12]等。Wu等[13]對(duì)冬蟲(chóng)夏草微波消解后， 用ICP-AES測(cè)量其中的Cr、Cd、Pb、As、Hg和Ni。Rizwan等[14]以氯化膽堿、苯酚配制低共熔溶劑（DESs），萃取水、食品中的Pb2+， 并利用石墨爐原子吸收光譜儀（GF-AAS）進(jìn)行了測(cè)定。但是， 這些方法所用儀器昂貴， 操作復(fù)雜， 對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所要求高。如原子吸收光譜儀測(cè)定不同元素需更換光源燈; 原子熒光光譜法則由于可與氫化物發(fā)生反應(yīng)的元素有限， 限制了該方法的應(yīng)用[15，16]， 因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性好的重金屬檢測(cè)方法仍是目前研究的熱點(diǎn)。

核酸適配體[17]因其特異性好、靶分子范圍廣、可體外合成和易于修飾等特點(diǎn)被廣泛用于重金屬檢測(cè)。本研究組利用核酸適配體和石英晶體微天平技術(shù)構(gòu)建了用于檢測(cè)Pb2+和As3+的壓電生物傳感器[18，19]。Huang等[20]利用核酸適配體和AuNPs， 基于HCR雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)， 制備了一種簡(jiǎn)單快速、操作簡(jiǎn)單的Pb2+比色生物傳感器。目前報(bào)道的Cd2+適配體傳感器多使用2014年Wu等[21]利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選出的核酸適配體序列， 但該序列含有大量的T和G堿基， 導(dǎo)致Pb2+ 和Hg2+ 容易對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成嚴(yán)重的干擾。2016年，Wang等[22]篩選出一條新的Cd2+核酸適配體， 其解離系數(shù)與之前的適配體相當(dāng)， 但具有更高的靶標(biāo)特異性， 因而更適合應(yīng)用于發(fā)展Cd2+傳感器。2019年，Zhou等[23]利用該適配體建立了一種Cd2+ 熒光檢測(cè)方法， 檢出限為3 nmol/L， 并證明Cd2+與適配體的結(jié)合力強(qiáng)于適配體與其部分互補(bǔ)序列之間的堿基配對(duì)作用力， Cd2+存在時(shí)， 可將適配體序列從雙鏈DNA中解離。

電化學(xué)傳感器[24～26]具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)， 基于適配體構(gòu)建的電化學(xué)傳感器由于其檢測(cè)速度快、設(shè)備簡(jiǎn)單易操作、檢測(cè)范圍寬、靈敏度高， 被廣泛用于醫(yī)療和食品安全等領(lǐng)域[27～31]。2017年， Lotfi等[32]基于Cd2+與適配體的特異性結(jié)合， 誘導(dǎo)適配體單鏈DNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 使修飾亞甲基藍(lán)的DNA的 3′端靠近電極表面， 通過(guò)亞甲基藍(lán)電化學(xué)信號(hào)的增強(qiáng)， 實(shí)現(xiàn)了Cd2+的靈敏檢測(cè)， 但該方法靈敏度較低， 檢出限僅為92 nmol/L， 無(wú)法滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飲用水中鎘的最高限量（44.5 nmol/L）檢測(cè)要求。 因此， 建立一種高靈敏檢測(cè)Cd2+的方法非常必要。

基于Wang等[22]篩選的Cd2+適配體， 本研究發(fā)展了一種“Turn-off”型核酸適配體電化學(xué)傳感器， 通過(guò)Cd2+與適配體的特異性結(jié)合， 使適配體與其互補(bǔ)序列解鏈， 使傳感器表面的電化學(xué)信號(hào)大幅降低， 基于此實(shí)現(xiàn)Cd2+的靈敏檢測(cè)。與傳統(tǒng)的交流伏安 （ACV） 法和微分脈沖伏安 （DPV） 法相比， 方波伏安（SWV）法可以在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)分析正向、反向電流以及凈電流， 從而獲得較寬電位范圍的電位圖， 提高檢測(cè)靈敏度， 縮短檢測(cè)時(shí)間[33]。本研究利用二茂鐵（Fc）標(biāo)記的核酸適配體與Cd2+之間的度親和力， 采用SWV檢測(cè)， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cd2+的高靈敏快速分析， 檢出限達(dá)到pmol/L級(jí)別， 并對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了分析檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

TC-XP-G PCR儀（杭州博日科技有限公司）; VORTEX-5旋渦混合儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）; FA2204B電子天平（杭平公司）; S210 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）; CHI660E電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）; TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）; Savant AA石墨爐原子吸收分光光度計(jì)（澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司）。

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、巰基己醇（MCH）、三-（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）（Sigma-Aldrich公司）;? K3[Fe（CN）6]、KCl、NaCl、CdCl2、HgCl2、ZnCl2、CuCl2、FeCl2、Pb（Ac）2、H2O2（30%）、濃H2SO4、無(wú)水乙醇、NaH2PO4、K2HPO4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）。所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水（≥18.3 MΩ·cm）。

電化學(xué)檢測(cè)采用三電極體系： 金電極（Au， 直徑2 mm）為工作電極， 鉑絲為對(duì)電極， Ag/AgCl電極為參比電極。電極均購(gòu)于武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司。

所用DNA核酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，3′修飾Fc的Cd2+適配體（Cd Apt）序列為： 5′-CTCAGGACGACGGGTTCACAGTAGGTTGTC-Fc-3′; 5′修飾巰基的部分互補(bǔ)序列為： 5′-SH-ACTAATGATCTGTGTAATGCTGTGAACCCGTCGTCCTGAG-3′。

2.2 自組裝膜金電極的制備

將100 μmol/L CDNA在95℃加熱變性5 min， 降溫至25℃， 靜置5 min， 加入等體積3 mmol/L TCEP， 用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含100 mmol/L NaCl， pH 7.4）稀釋至10 μmol/L， 于4℃保存。

取20 μL上述制備好的CDNA溶液， 將處理好的金電極[34，35]浸沒(méi)其中， 置于25℃恒溫箱反應(yīng)16 h， 用10 mmol/L Tris緩沖液（含100 mmol/L NaCl， pH 7.4）洗凈， 在氮?dú)庀麓蹈桑?浸入1 mmol/L MCH 1 h， 封閉空余的電極表面， 然后滴加15 μL 5 μmol/L Cd Apt， 25℃恒溫箱中反應(yīng)30 min， 得到雙鏈DNA修飾的自組裝膜金電極（Au/CDNA/MCH/Cd Apt）， 于4℃保存。每一步的電極組裝過(guò)程均采用CV法和電化學(xué)阻抗譜（EIS）測(cè)試。

2.3 電化學(xué)檢測(cè)Cd2+

將制備的Au/CDNA/MCH/Cd Apt浸入20 μL不同濃度的Cd2+溶液中反應(yīng)30 min， 用緩沖液洗凈， 氮?dú)獯蹈桑?在10 mmol/L PBS（含100 mmol/L NaCl， pH 7.4）中， 采用SWV法測(cè)定， 參數(shù)設(shè)置： 電位0.6～0.2 V， 頻率（Frequency） 25 Hz， 階躍電位（Step potential） 4 mV， 振幅（Amplitude） 25 mV。

2.4 樣品處理和鎘離子的測(cè)定

黃浦江水采集自上海楊浦段。水樣以8000 r/min離心15 min， 過(guò)0.22 μm膜， 用10 mmol/L Tris緩沖液（含100 mmol/L NaCl， pH 7.4）調(diào)至pH 7.4， 采用本方法進(jìn)行測(cè)定， 并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， 計(jì)算回收率。同時(shí)， 使用石墨爐原子吸收光譜法（GF-AAS）測(cè)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

本研究基于Cd2+適配體對(duì)Cd2+的高特異性親和力， 采用競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)現(xiàn)響應(yīng)信號(hào)“Turn off”變化， 發(fā)展了一種檢測(cè)Cd2+的電化學(xué)生物傳感器。實(shí)驗(yàn)原理示意圖見(jiàn)圖1， 5′端修飾巰基的CDNA通過(guò)AuS鍵固定在金電極上， 隨后將適配體Cd Apt滴加到電極表面， 與CDNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)， 形成部分互補(bǔ)的雙鏈DNA， 剛性的雙鏈結(jié)構(gòu)可極大地增加電極表面直立狀態(tài)DNA的數(shù)量。由于Cd Apt 的3′端修飾有Fc， Fc靠近電極， 引起高強(qiáng)度的信號(hào); 當(dāng)Cd2+存在時(shí)， Cd Apt與Cd2+發(fā)生特異性結(jié)合， 破壞DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)， 使Cd Apt游離出來(lái)， 修飾電極Fc的電流信號(hào)隨之減弱， 使用SWV法通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)Cd2+的快速、靈敏檢測(cè)。相比于電極表面直接修飾適配體序列， 利用競(jìng)爭(zhēng)法， 靶分子與適配體結(jié)合， 與互補(bǔ)序列分離， 有利于增強(qiáng)電極表面電阻抗的變化程度， 提高了靈敏度。

3.2 電極修飾過(guò)程的表征

采用CV法表征金電極表面互補(bǔ)序列CDNA和無(wú)修飾適配體Cd Apt的相互作用過(guò)程， 結(jié)果如圖2A所示。裸金電極（圖2A曲線a）在0.2 V處出現(xiàn)一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰， 峰電流差值為140 μA; 修飾巰基的CDNA在裸金電極表面形成導(dǎo)電性較差的自組裝膜， 阻礙[Fe（CN）6]3-/4-在電極表面的電子傳遞， 峰電流差值減?。▓D2A曲線b）; 采用MCH封閉電極表面空余結(jié)合位點(diǎn)， 以減少非特異性吸附， 進(jìn)一步減少了電子傳遞， 導(dǎo)致峰電流差值進(jìn)一步減小， 氧化還原峰位出現(xiàn)較大的位移（圖2A曲線c）;

無(wú)修飾適配體序列Cd Apt與CDNA通過(guò)雜交反應(yīng)在電極表面形成剛性雙鏈DNA， 峰電流差值略降， 氧化還原峰位也有顯著位移（圖2A曲線d）; 將Cd2+溶液滴加到電極表面后， Cd2+與適配體Cd Apt發(fā)生特異性結(jié)合， 使Cd Apt從雙鏈DNA中解離出來(lái)， 峰電流差值恢復(fù)到只有CDNA和MCH的狀態(tài)（圖2A曲線f）。EIS表征結(jié)果如圖2B所示， 在高頻區(qū)觀察到的半圓部分直徑增大， 反映出界面電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）增加， EIS表征結(jié)果與CV的表征結(jié)果一致， 表明此電化學(xué)生物傳感器可以實(shí)現(xiàn)Cd2+的電化學(xué)檢測(cè)。

3.3 SWV法檢測(cè)Cd2+

采用SWV檢測(cè)修飾電極對(duì)Cd2+的電化學(xué)響應(yīng)。Au/CDNA/MCH/Cd Apt電極在0.38 V附近出現(xiàn)Fc的信號(hào)峰（圖3a）， 當(dāng)電極與5 μmol/L Cd2+溶液孵育后， Fc的信號(hào)峰電流值減?。▓D3b）。這是因?yàn)镃d2+與Cd Apt發(fā)生特異性結(jié)合， 使標(biāo)記了FC的適配體Cd Apt從雙鏈中解離， Fc遠(yuǎn)離電極表面， 因此峰電流降低。

3.4 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

對(duì)影響電化學(xué)傳感器分析性能的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化， 包括適配體互補(bǔ)序列CDNA在金電極上的自組裝時(shí)間、CDNA濃度、CDNA與Cd Apt的用量比例、傳感器與Cd2+反應(yīng)的時(shí)間等。隨著CDNA在金電極上自組裝時(shí)間延長(zhǎng)， Au/CDNA/MCH/Cd Apt電極與Cd2+反應(yīng)前后的峰電流差值越來(lái)越大（圖4A）， 10 h后逐漸趨于平緩， 16 h時(shí)反應(yīng)完全， 因此選擇16 h為CDNA在金電極上的最佳自組裝時(shí)間。隨著滴加在金電極表面CDNA濃度逐漸增加， 電流差值逐漸增大（圖4B）， 當(dāng)CDNA濃度為10 μmol/L時(shí)， 電流差值最大;? CDNA濃度繼續(xù)增高， 電流差值反而逐漸減弱， 可能是CDNA濃度過(guò)高時(shí)， 產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)阻礙了電子傳遞， 導(dǎo)致電流降低， 所以選擇10 μmol/L為最適CDNA濃度。當(dāng)CDNA與Cd Apt的用量比為1∶0.5時(shí)（即CDNA為10 μmol/L， Cd Apt為5 μmol/L）， 電流差值最大（圖4C）， Cd Apt濃度過(guò)低時(shí)， 可能導(dǎo)致電極表面固定的大量CDNA缺乏Cd Apt與之雜交， 電流差值較小; 當(dāng)Cd Apt濃度過(guò)高， 電極表面的雙鏈DNA密度大， 空間位阻大， 不利于Cd2+與Cd Apt的結(jié)合以及Cd Apt從電極表面雙鏈DNA中的脫離。隨著Cd2+與傳感器反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 電流差值逐漸增大， 30 min時(shí)逐漸平緩， 表明反應(yīng)趨于完全， 因此選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min（圖4D）。

3.5 Cd2+適配體傳感器的檢測(cè)性能

測(cè)量了傳感器對(duì)不同濃度Cd2+的SWV響應(yīng)， 結(jié)果如圖5所示。以Au/CDNA/MCH/Cd Apt電極測(cè)得的信號(hào)值為空白值I0， Cd2+與適配體Cd Apt發(fā)生特異性反應(yīng)后， 以Au/CDNA/MCH/Cd Apt/Cd2+電極測(cè)得的電流值為I1， 如圖5B所示， 在1.0 nmol/L～10.0 μmol/L范圍內(nèi)， Cd2+濃度的對(duì)數(shù)值（lgC）與電流差值ΔI（I1-I0）有良好的線性關(guān)系， 線性回歸方程為： ΔI=0.2872+0.2327lg[C/（nmol/L））， 相關(guān)系數(shù)R2=0.9972，檢出限（3σ）為65.1 pmol/L。

考察了傳感器對(duì)其它二價(jià)金屬陽(yáng)離子（Pb2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+和Fe2+）的電化學(xué)響應(yīng)， 如圖6所示， 此生物傳感器僅對(duì)Cd2+（5 μmol/L）有明顯的電化學(xué)響應(yīng)， 而對(duì)于相同濃度其它金屬離子的響應(yīng)非常微弱， 表明此傳感器對(duì)Cd2+具有較高的選擇性。相比于文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)Cd2+的方法， 本方法具有較低的檢出限（表1）。

3.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)黃浦江水樣進(jìn)行直接分析， 未檢出Cd2+。在水樣中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， Cd2+的添加水平為1.0、10和100 nmol/L， 回收率分別是97.1%、 97.9%和99.5%（表2）， 本方法的測(cè)量結(jié)果與我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[40]使用的Cd2+檢測(cè)方法-石墨爐原子吸收光譜法（GF-AAS）的測(cè)量結(jié)果一致， 表明本方法在實(shí)際水樣檢測(cè)中具有良好的實(shí)用性。

4 結(jié) 論

基于適配體對(duì)Cd2+的特異性競(jìng)爭(zhēng)性識(shí)別作用構(gòu)建了適配體電化學(xué)生物傳感器， 實(shí)現(xiàn)了水樣中Cd2+的超靈敏檢測(cè)， 檢出限（3σ）為65.1 pmol/L。本傳感器操作簡(jiǎn)單方便， 無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理或濃縮等步驟。采用方波伏安法（SWV）對(duì)Cd2+進(jìn)行檢測(cè)， 可檢測(cè)的線性范圍寬（1 nmol/L～10 μmol/L）， 實(shí)際江水樣品中Cd2+的回收率為97.1%～99.5%。本研究構(gòu)建的Cd2+適配體電化學(xué)傳感器檢出限低、靈敏度高、特異性好， 具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。

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