謝漢釗　楊斌　李建平

摘 要 制備了赤霉素（GA3）分子印跡傳感器，建立了基于共振能量轉(zhuǎn)移原理增強Ru（bpy）3Cl2電化學發(fā)光（ECL）信號超靈敏測定GA3的方法。在玻碳電極表面滴涂摻雜Au的g-C3N4材料（g-C3N4/Au），進一步電化學聚合鄰苯二胺，得到分子印跡聚合物（MIP）膜，采用甲醇-乙酸洗脫液洗脫后，得到可特異性識別GA3的空穴。以Ru（bpy）32+為探針，g-C3N4/Au為能量供體，利用二者間共振能量轉(zhuǎn)移增強Ru（bpy）32+的ECL強度。同時，ECL共振能量轉(zhuǎn)移與分子印跡技術(shù)結(jié)合，提高傳感器的選擇性。隨著樣品中GA3濃度增加，分子印跡空穴與GA3重新結(jié)合， 導致ECL強度逐漸降低。此傳感器檢測GA3的線性范圍為4.0×10-14～7.0×10-11 mol/L，檢出限為1.64×10-14 mol/L。將此傳感器用于啤酒中GA3檢測，回收率為95.7%～103.7%。

關(guān)鍵詞 分子印跡; 赤霉素; 電化學發(fā)光; 共振能量轉(zhuǎn)移; g-C3N4/Au

1 引 言

分子印跡電化學傳感器是能選擇性識別特定分子并產(chǎn)生信號變化的檢測裝置[1]，廣泛應用于環(huán)境分析、食品安全、生物醫(yī)藥檢測等領(lǐng)域[2，3]。然而，傳統(tǒng)的分子印跡電化學傳感器因受限于分子印跡聚合物（MIP）導電性弱和電活性差， 導致其靈敏度不高。分子印跡電化學發(fā)光法集電化學發(fā)光（ECL）的高靈敏度和分子印跡技術(shù)的高選擇性于一體，有較好的發(fā)展前景[2，4]。然而，常規(guī)的ECL強度因受施加電位影響，產(chǎn)生光子能量較高但數(shù)量較少，靈敏度相對較低。電化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（ECL-RET）利用供體在電極表面發(fā)生電化學反應后， 將能量轉(zhuǎn)移給受體，使受體吸收能量而發(fā)光，可顯著提高ECL分析靈敏度[5，6]，因而在DNA、蛋白質(zhì)、細胞及無機分子檢測等研究中得到應用[7～10]。

赤霉素（GA3）是植物生長發(fā)育不可缺少的激素之一，在育苗、保護地栽培以及露地栽培等方面廣泛使用。但是，GA3會影響動物的生長發(fā)育，甚至導致機體發(fā)生癌變，因此檢測GA3具有重要意義。目前，檢測GA3的方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、伏安分析法、表面增強拉曼散射法等[11～14]，但這些方法存在靈敏度不高、選擇性差、需要復雜的前處理、儀器昂貴、溶劑用量大等缺點。本研究組曾利用分子印跡ECL傳感器測定GA3[15]，但該方法靈敏度仍有待提高。

g-C3N4是一種高效、穩(wěn)定的發(fā)光材料，已被用于制備多種類型的化學傳感器[16]。g-C3N4/Au的發(fā)射峰與Ru（bpy）3Cl2的吸收峰相近，可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移而得到更強的ECL信號，提高檢測靈敏度[17]。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了以g-C3N4/Au為基質(zhì)的分子印跡傳感器，利用g-C3N4/Au供體與Ru（bpy）3Cl2受體間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移從而大大增強ECL信號的ECL共振能量轉(zhuǎn)移原理，結(jié)合“門控制”效應[18]，提高檢測的靈敏度。傳感器制備過程及檢測原理如圖1所示。在玻碳電極上修飾一層g-C3N4/Au材料，以GA3作為模板分子，鄰苯二胺作為功能單體，電聚合制備分子印跡傳感器。將模板分子洗脫后，得到可識別GA3的印跡空穴。施加電壓，使g-C3N4/Au處于激發(fā)態(tài)，當Ru（bpy）32+通過空穴到達電極表面，激發(fā)態(tài)g-C3N4/Au的能量轉(zhuǎn)移到Ru（bpy）32+，使ECL信號增強，實現(xiàn)對GA3的高靈敏檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PGSTAT128N Autolab電化學工作站（瑞士萬通有限公司）; MPI-E型電化學發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁儀器有限公司）;? PHS-3C型實驗室pH計（上海錦幻儀器儀表公司）; 80-2B離心機（金壇市醫(yī)療儀器廠）;? AVANCE III Bruker-500 MHz核磁共振儀（荷蘭Bruker公司）; ∑IGMA場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）; TU-1901紫外-可見光分光光度計（北京普析通用公司）; JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）; 日立F-7000熒光分光光度計（株式會社日立制作所）。采用三電極系統(tǒng)：工作電極為直徑2 mm的玻碳電極（GCE），對電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl。

鄰苯二胺、GA3和聯(lián)吡啶釕（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 三聚氰胺（C3H6N6，國藥集團化學試劑有限公司）; 二水合檸檬酸三鈉、K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]、KCl（汕頭隴西化工廠）; NaBH4（國藥集團化學試劑有限公司）。 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（含0.1 mol/L KCl，pH 8.0）; 0.2 mol/L硼酸-硼砂緩沖液（含0.1 mol/L KCl，pH 9.0）; 0.005 mol/L K3[Fe（CN）6]-K4[Fe（CN）6]溶液（含0.1 mol/L KCl）。 所用試劑均為分析純，無需純化。實驗用水為蒸餾水。

2.2 修飾材料的制備

2.2.1 g-C3N4的制備 參照文獻[19]合成g-C3N4。準確稱取10 g三聚氰胺， 均勻地放入帶蓋的陶瓷坩堝中，將其放入馬弗爐中進行高溫燒結(jié)：在120 min內(nèi)升溫至500℃并恒溫反應120 min，再加熱到520℃恒溫反應120 min，自然冷卻至室溫，取出樣品，研磨過篩，即得到g-C3N4的粗品。

參照文獻[20]對所得粗品進行提純：將制得的g-C3N4粗品溶于水中，超聲處理30 min， 離心并水洗3次，去除可溶性的反應物和雜質(zhì)，再用無水乙醇清洗并離心3次，以去除一些有機雜質(zhì)，在60℃下干燥，將所得樣品研磨至粉末，備用。

2.2.2 g-C3N4/Au的制備 參照文獻[20]合成g-C3N4/Au。準確稱取10 mg g-C3N4溶于4 mL去離子水，超聲處理30 min，然后加入20 μL 0.1 mol/L HAuCl4。超聲處理10 min，攪拌30 min，重復3次。加入126 μL 0.04 mol/L NaBH4，攪拌20 min。繼續(xù)加入200 μL 0.01 mol/L檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌30 min。離心并水洗3次，去除可溶性的反應物和雜質(zhì)，最后溶于4 mL水中。

2.3 MIP膜修飾電極的制備

用0.05 μm Al2O3粉將GCE拋光，然后分別在HNO3（1∶1，V/V）、無水乙醇、水中超聲洗滌5 min，然后參照文獻[20]將g-C3N4/Au滴涂到GCE上。將鄰苯二胺用硼酸-硼砂緩沖溶液（pH 9.0）溶解，將電極置于10 mL含1.0×10-4 mol/L鄰苯二胺和1.0×10-4 mol/L GA3聚合液中進行循環(huán)伏安掃描，電位范圍-0.2 ～+0.6 V，聚合20圈。使用同樣的方法，用硼酸-硼砂緩沖溶液代替GA3溶液加入到聚膜液中，制得非分子印跡（NIP）修飾電極; 使用同樣的方法，在未修飾GCE上制備MIP膜。將已制備好的MIP、NIP修飾電極和未修飾復合材料的MIP電極置于甲醇-乙酸（8∶3，V/V）溶液中，洗脫150 s，去除膜中的模板分子GA3及膜表面的附著物，用水清洗后，晾干，備用。

2.4 測量方法

電化學測試在0.005 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]（含0.1 mol/L KCl）溶液中進行。掃描速率為50 mV/s，電壓掃描范圍為-0.2 ～0.6 V; 交流阻抗（EIS）法的恒電位為0.190 V，交變電壓5 mV，頻率范圍100 mHz～100 kHz。

ECL信號測試是將制備好的工作電極置于不同濃度的GA3溶液中進行重吸附后，將其浸入到7 mL發(fā)光底液中，采用三電極系統(tǒng)測定發(fā)光強度。電壓掃描范圍為0～1.2 V，掃速為100 mV/s，光電倍增管高壓800 V，放大倍數(shù)為4級。發(fā)光底液由5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液與2 mL 1.5 mmol/L聯(lián)吡啶釕溶液混合得到。

3 結(jié)果與討論

3.1 復合材料g-C3N4/Au的形貌和成分表征

對制備的g-C3N4/Au進行EDX能譜測試，如圖2A所示， g-C3N4/Au復合材料中包含Au、N、C等元素，說明成功制備了復合材料g-C3N4/Au。

g-C3N4/Au復合材料的X-射線衍射圖見圖2B。g-C3N4在27.7°處有一個特征峰（002），與晶面堆積的共軛芳香體系有關(guān)。摻雜納米金后，g-C3N4/Au在38.1°和44.4°出現(xiàn)金的特征峰，晶面類型分別是（111）和（200）。上述結(jié)果表明， g-C3N4/Au復合材料合成成功。

g-C3N4和g-C3N4/Au的透射電鏡和掃描電鏡表征結(jié)果見圖3。在圖3A和3C中，g-C3N4呈現(xiàn)片狀分布; 在圖3B和3D圖中，可見一些顆粒狀物質(zhì)均勻分布于g-C3N4表面，這些顆粒多呈球形，直徑約30 nm。 綜合圖3的結(jié)果，可以判斷這些顆粒為納米金，附著于g-C3N4表面，即得到g-C3N4/Au。

3.2 MIP的電聚合

采用循環(huán)伏安法（CV）進行MIP的電聚合[20，21]。在GCE表面電聚合鄰苯二胺是不可逆的氧化過程，且隨著電聚合掃描圈數(shù)不斷增加，氧化峰電流明顯降低，并趨于穩(wěn)定，說明隨著掃描圈數(shù)的不斷增加，在GCE上逐漸生成一層致密的MIP膜，阻礙了電子傳遞，導致氧化峰電流隨著掃描的進行而不斷降低。

3.3 MIP膜的差分脈沖伏安法（DPV）和CV表征

利用DPV和CV法對MIP膜的電化學性能進行研究。GA3本身在掃描范圍內(nèi)無電活性，選擇在0005 mol/L K4[Fe（CN）6]-K3[Fe（CN）6]溶液（含0.1 mol/L KCl）中進行表征，在-0.2～+0.6 V范圍內(nèi)進行掃描并記錄響應曲線。如圖4所示，K4[Fe（CN）6]-K3[Fe（CN）6]探針在GCE上有明顯的氧化峰（曲線a），修飾g-C3N4/Au后，氧化峰增強（曲線b），這是因為g-C3N4/Au具有良好的導電性能及較大的比表面積，增強了探針分子的氧化峰信號。進一步在其表面電聚合形成MIP后，由于MIP膜致密且導電性較差，嚴重阻礙電子的傳遞能力，氧化峰電流急劇下降（曲線c）; 而用洗脫液洗脫模板分子后，探針分子氧化電流強度增大（曲線d），這是由于模板分子去除后，印跡孔穴作為電子傳遞通道，利于探針分子通過MIP進行電子傳遞; 而將電極置于8.0×10-12 mol/L GA3溶液中進行重吸附后，由于印跡孔穴與模板分子GA3重新復合，GA3重新占據(jù)印跡孔穴，電子傳遞通道被堵塞，導致氧化峰電流下降（曲線e）。上述結(jié)果說明，此印跡孔穴對GA3分子有識別吸附作用。

為排除識別的非特異性吸附的因素，考察了不含模板分子的印跡膜（NIP）對目標分子的識別效果，結(jié)果見圖4插圖，對于NIP，電聚合過程后（曲線f）和進一步洗脫后（曲線g）的氧化電流值都很小，且與電聚合得到的MIP的電流值相當，說明NIP不能提供電子探針參加電極反應的通道。因此，NIP對GA3不產(chǎn)生識別吸附，即可排除MIP的非特異性吸附。

3.4 MIP膜的EIS表征

MIP傳感器的表面阻抗的變化如圖5（擬合軟件：ZSimDemo 3.30d）所示。曲線a為GCE（194 Ω）; 曲線b為g-C3N4/Au修飾GCE（180 Ω）。對于MIP修飾GCE，電極表面的電阻增大（曲線c，12200 Ω）; 當模板分子被洗脫后，傳質(zhì)通道被打開，電導率增加，電阻降低 （曲線d，322 Ω）。重吸附不同濃度GA3后，由于印跡空穴被重新占據(jù)，傳質(zhì)通道被堵塞，電極的電阻增大（曲線e，556 Ω; 曲線f，806 Ω）。EIS表征與CV、DPV表征結(jié)果一致，證明MIP修飾電極已經(jīng)制備成功。

3.5 實驗條件優(yōu)化

3.5.1 MIP膜聚合膜條件優(yōu)化 改變模板分子與功能單體的配比（1∶3，1∶4，1∶5）進行MIP合成條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)配比為1∶3時，MIP膜的穩(wěn)定性、洗脫效果等最優(yōu)。此外，分別考察MIP膜聚合時，掃描15、20、25和30圈得到的MIP。當聚膜圈數(shù)為20圈時，聚合后的電流趨于穩(wěn)定，同時洗脫時間也適中（約150 s），因此選擇聚膜掃描圈數(shù)為20圈。

進一步探索此體系在ECL中的能量轉(zhuǎn)移情況。圖11是MIP-ECL傳感器在不同情況下的ECL信號變化。 曲線a為洗脫后的未修飾g-C3N4/Au復合材料的MIP電極。由于g-C3N4/Au復合材料與發(fā)生能量轉(zhuǎn)移作用，增大了發(fā)光強度（曲線b），證明已經(jīng)修飾上g-C3N4/Au。當重吸附不同濃度的GA3后（曲線c和曲線d），印跡空穴被不同程度堵住，g-C3N4/Au與Ru（bpy）3Cl2能量轉(zhuǎn)移效率降低，ECL的響應信號也相應降低。同時，對比曲線a和b的ECL強度可知，能量轉(zhuǎn)移作用增強了ECL信號，放大倍數(shù)約為3倍，能量轉(zhuǎn)移對ECL信號起到明顯的放大作用。

3.10 實際樣品分析

3個不同品牌的啤酒樣品購于本地超市。將啤酒進行超聲振蕩排氣，過濾后，取0.01 mL稀釋至4 mL。采用g-C3N4/Au-MIP傳感器測定GA3濃度，結(jié)果見表2，GA3回收率為95.7%～103.7%，RSD<5%。

4 結(jié) 論

制備了MIP傳感器，基于g-C3N4/Au增強Ru（bpy）3Cl2的電化學發(fā)光信號的ECL-RET原理建立了GA3的測定方法。與已報道的檢測方法相比較，本方法特異性好、靈敏度高、檢出限低。同時，利用MIP傳感器的ECL-RET法為其它不能或產(chǎn)生極弱電化學發(fā)光的物質(zhì)的檢測提供了新思路。

References

1 Xing R R， Wang S S， Bie Z J， He H， Liu Z. Nat. Protoc.， 2017， 12（5）： 964-987

2 Ahmad O S， Bedwell T S， Esen C， Garcia-Cruz A， Piletsky S A. Trends Biotechnol.，? 2019，? 37（3）：? 294-309

3 Yang B， Fu C， Li J P， Xu G B. TrAC-Trends Anal. Chem.，? 2018，? 105：? 52-67

4 Wang Z H， Yu R Z， Zeng H， Wang X X， Luo S Z， Li W H， Luo X L， Yang T. Microchim. Acta，? 2019，? 186（7）：? 405-423

5 Neema P M， Tomy A M， Cyriac J. TrAC-Trends Anal. Chem.，? 2020：?? 124： 115797

6 Chu Y X， Han T T， Deng A P， Li L L， Zhu J J. TrAC-Trends Anal. Chem.，? 2020：?? 123： 115745

7 Li L L， Chen Y， Lu Q， Ji J， Shen Y Y， Xu M， Fei R， Yang G H， Zhang K， Zhang J R， Zhu J J. Sci. Rep.，? 2013，? 3：? 1529-1539

8 Cheng Y， Lei J P， Chen Y L， Ju H X. Biosens. Bioelectron.，? 2014，? 51：? 431-436

9 Baba Y， Yamamoto K， Yoshida W. Anal. Bioanal. Chem.，? 2019，? 411（19）：? 4765-4773

10 Wu M S， Shi H W， Xu J J， Chen H Y. Chem. Commun.，? 2011，? 47（27）：? 7752-7754

11 Wei Q， Lin J， Liu F， Wen CC， Li N， Huang G B， Luo Z H. Sensors，? 2019，? 19（23）：? 5152-5156

12 Pan C Z， Tan S N， Yong J W H， Ge L Y. J. Sep. Sci.，? 2017，? 40（1）：? 346-360

13 Liu C M， Li D M， Li J C， Guo Z P， Chen Y. Plant J.，? 2019，? 99（5）：? 1014-1024

14 Deng T， Wu D P， Duan C F， Yan X H， Du Y， Zou J， Guan Y F. Anal. Chem.，? 2017，? 89（17）：? 9537-9543

15 Li J S， Li S H， Wei X P， Tao H L， Pan H C. Anal. Chem.，? 2012，? 84（22）：? 9951-9955

16 Feng S S， Wei X P， Zhong L， Li J P. Electroanalysis，? 2018，? 30（2）：? 320-327

17 Feng Q M， Shen Y Z， Li M X， Zhang Z L， Zhao W， Xu J J， Chen H Y. Anal. Chem.，? 2016，? 88（1）：? 937-944

18 Li J P， Zhao J， Wei X P. Sens. Actuators B，? 2009，? 140（2）： 663-669

19 Zhu Z， Lu Z Y， Zhao X X， Yan Y S， Shi W D， Wang D D， Yang L L， Lin X， Hua Z F， Liu Y. RSC Adv.，? 2015，? 5（51）：? 40726-40736

20 Yin H S， Sun B， Dong L F， Li B C， Zhou Y L， Ai S Y. Biosens. Bioelectron.，? 2015，? 64：? 462-468

21 ZHANG Lian-Ming， WEI Xiao-Ping， WEI Yan-Xi， LI Jian-Ping， ZENG Ying. Chinese J. Anal. Chem.，? 2014，? 42（11）：? 1580-1585

張連明， 魏小平， 韋衍溪， 李建平， 曾 英. 分析化學， 2014，?? 42（11）：? 1580-1585

22 Zhu G M， Long S H， Sun H， Luo W， Li X， Hao Z B. J. Chromatogr. B，? 2013，? 941：? 62-68

23 Lu Y H， Cao Y M， Guo X F， Hong W， Zhang H S. Anal. Methods，? 2016，? 8（7）：? 1520-1526

A Molecularly Imprinted Electrochemical Luminescence

Sensor for Detection of Gibberellin Based on Energy Transfer

XIE Han-Zhao， YANG Bin， LI Jian-Ping*

（College of Chemical and Bioengineering， Guilin University of Technology，

Guangxi Key Laboratory of Electrochemical and Magnetochemical Function Materials， Guilin 541004，China）

Abstract A molecularly imprinted sensor was fabricated， and a method based on enhancing electrochemiluminescence （ECL） signal of Ru（bpy）3Cl2 using resonance energy transfer （RET） was established for ultra-sensitive determination of gibberellin （GA3）. Au-doped g-C3N4 （g-C3N4/Au） was prepared on the surface of glassy carbon electrode， and then o-phenylenediamine was electropolymerized to achieve a molecularly imprinted polymer （MIP） film. The film was then eluted by methanol-acetic acid to obtain molecularly imprinted cavities for specifically recognizing GA3. Ru（bpy）32+ was used as probe and g-C3N4/Au was used as energy donor. The RET between Ru（bpy）32+ and g-C3N4/Au was used to enhance ECL intensity of Ru（bpy）32+. In addition， ECL-RET was combined with molecular imprinting technology to improve selectivity of the sensor. With the increase of the concentration of GA3， the molecularly imprinted cavities recombined with GA3， which made the ECL intensity gradually decreased. Under the optimized conditions， there was a linear relationship between ECL intensities and GA3 concentrations in the range from 4.00×10-14 mol/L to 7.00 ×10-11 mol/L， and the detection limit was 1.64×10-14 mol/L （3S/K）. The sensor was successfully applied to the detection of GA3 in beer， and the recoveries were 95.7%-103.7%.

Keywords Molecularly imprinting; Gibberellins; Electrochemical luminescence; Resonance energy transfer; g-C3N4/Au

（Received 5 April 2020; accepted 8 August 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21765006）， the Guangxi Natural Science Foundation of China （No. 2018GXNSFAA138145） and Guangxi?Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area， China.

2020-04-05收稿; 2020-08-08接受

本文系國家自然科學基金項目（No.21765006）、廣西自然科學基金項目（No.2018GXNSFAA138145）和廣西巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心項目資助

* E-mail： likianping@263.net