楊子霖 王志蓮

宮頸癌(cervical cancer, CC)是全球女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，導(dǎo)致宮頸癌的危險(xiǎn)因素主要有高危型HPV(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)感染、多產(chǎn)、多性伴侶、早期性生活、吸煙以及不良的衛(wèi)生習(xí)慣[1]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads通路和自噬共同參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展，而且二者可以協(xié)同促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，因此，明確宮頸癌發(fā)展的TGF-β1/Smad4通路和自噬的相互作用可能為預(yù)防和治療子宮頸癌提供潛在的理論依據(jù)[2]。

已有研究表明，TGF-β1/ Smad4信號(hào)通路在許多類型的癌癥中發(fā)揮作用，包括宮頸癌。在其早期，TGF-β1可以抑制上皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，而在宮頸癌晚期，TGF-β1則通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，Smad4是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心介質(zhì)，在TGF-β1介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生中的功能轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用[3]。Smad4在宮頸癌中常表現(xiàn)為基因突變或缺失，從而使TGF-β1/ Smad4信號(hào)通路中斷，減弱了其抑制效應(yīng)。因此，在TGF-β1/Smad4信號(hào)通路中的任何一部分的中斷或缺失，會(huì)導(dǎo)致該通路的抑癌作用減弱，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展。

自噬是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的一種自我消耗機(jī)制，是自噬體吞噬了衰老損傷的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和多余的脂質(zhì)與溶酶體融合后發(fā)生降解，其產(chǎn)物輸出到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行回收利用的一種生理性細(xì)胞途徑[4]。p62也稱為螯合物1(SQSTM1)，是一個(gè)廣泛使用的自噬標(biāo)志物，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，自噬體與溶酶體融合降解錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，p62的含量降低。當(dāng)自噬被抑制時(shí)，p62累積，而當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時(shí)，p62數(shù)量減少。

TGF-β1的自噬激活是通過(guò)Smad4和JNK途徑介導(dǎo)的,TGF-β1/Smad4通路與自噬的密切作用可能為促進(jìn)宮頸癌形成重要標(biāo)志。因此，本研究通過(guò)給予外源性TGF-β1和SIS3處理宮頸癌SiHa細(xì)胞，探討調(diào)控TGF-β1 /Smad4通路對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞自噬關(guān)鍵基因p62的影響。

材料與方法

1.材料來(lái)源：宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：人重組TGF-β1蛋白購(gòu)自美國(guó)BD公司；PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；PVDF 轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自德國(guó)Millipore公司；化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自德國(guó)Millipore公司；β-actin pAb購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；Trizol購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

3.實(shí)驗(yàn)分組及處理：復(fù)蘇SiHa細(xì)胞，后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中，水平放置于培養(yǎng)箱之中，按照一般細(xì)胞培養(yǎng)及傳代原則，定期換液，無(wú)菌操作。并定期觀察記錄。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部的80%時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入1ml 0.25%胰酶消化將SiHa細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液，以1.5×105/ml的濃度接種于所需數(shù)量的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，饑餓處理過(guò)夜，分為A、B、C、D、E、F共6個(gè)組，A、B、C組用移液器各加入等體積(0.5ml)提前配置好的含0、5、10ng/ml的TGF-β1的DMEM高糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后收取細(xì)胞；D、E、F組用移液器各加入等體積(0.5ml)提前配置好的含0、5、10ng/ml的SIS3的DMEM高糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后收取細(xì)胞。

4.標(biāo)本提取及檢測(cè)p62的mRNA表達(dá)量：SiHa細(xì)胞干預(yù)后加入20μl DEPC溶解RNA，-80℃保存。測(cè)定RNA濃度及A260/A280值，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物序列(5′→3′)如下：p62正向引物為AGGACAAATTGCGCCCATTT，p62反向引物為T(mén)CTCTTT-CAGGGACAGGCTG，β-actin 正向引物為T(mén)GGCACCCAGCAGCACAATGAA，β-actin反向引物為CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA。稀釋cDNA后加入20μl反應(yīng)體系。預(yù)變性(95℃，15min)→變性(95℃，30s)→ 退火(60℃，1min)→延伸(60℃，1min)；變性、退火、延伸共循環(huán)40次，計(jì)算結(jié)果。

5.標(biāo)本提取及檢測(cè)p62的蛋白表達(dá)量：取細(xì)胞干預(yù)后的6孔板，倒掉其培養(yǎng)液，PBS清洗6孔板3次，分別向每孔加入RIPA液100μl，震蕩后置于冰上20min；配置BCA工作液后計(jì)算蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，上樣加入Marker及樣品，電泳，轉(zhuǎn)膜及封閉，一抗孵育于4℃搖床過(guò)夜，次日蒸餾水清洗；洗滌PVDF膜、稀釋二抗，靜置1h，隨后再次洗膜。滴加ECL化學(xué)發(fā)光液于PVDF膜上目的蛋白區(qū)域，放于化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光檢測(cè)。

結(jié) 果

1.TGF-β1影響宮頸癌SiHa細(xì)胞中p62 mRNA表達(dá)水平：SiHa細(xì)胞分別在TGF-β1濃度為0(空白對(duì)照)、5、10ng/ml中培養(yǎng)24h后，檢測(cè)各組細(xì)胞中p62在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量，組間比較結(jié)果提示，mRNA相對(duì)表達(dá)量不全相同(F=30.359、P=0.001)，3組間兩兩比較結(jié)果提示,mRNA表達(dá)水平從大到小依次為0ng/ml組、5ng/ml組、10ng/ml組，0ng/ml組與5ng/ml組比較、0ng/ml組與10ng/ml組比較、5ng/ml組與10ng/ml組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.006、0.000、0.011，詳見(jiàn)圖1。

圖1 3種濃度TGF-β1對(duì)SiHa細(xì)胞p62mRNA表達(dá)水平的影響

2.TGF-β1影響宮頸癌SiHa細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)水平：p62的分子量為64kDa，以β-actin作為內(nèi)參。對(duì)圖2的結(jié)果進(jìn)行灰度值掃描后，以p62相對(duì)β-actin的灰度值比作為p62的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，0ng/ml組(空白對(duì)照)、5ng/ml組、10ng/ml組的p62相對(duì)表達(dá)量分別為0.978±0.024、0.781±0.060、0.627±0.088，組間比較結(jié)果提示，蛋白相對(duì)表達(dá)量不全相同(F=23.486、P=0.001)，3組間兩兩比較結(jié)果提示，蛋白表達(dá)水平從大到小依次為0ng/ml組、5ng/ml組、10ng/ml組，0ng/ml組與5ng/ml組比較、0ng/ml組與10ng/ml組比較、5ng/ml組與10ng/ml組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.009、0.000、0.024,詳見(jiàn)圖3。

圖2 3種濃度TGF-β1對(duì)SiHa細(xì)胞p62蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 3種濃度TGF-β1對(duì)SiHa細(xì)胞p62蛋白表達(dá)水平的影響

3.SIS3影響宮頸癌SiHa細(xì)胞中p62 mRNA表達(dá)水平：SiHa細(xì)胞分別在SIS3濃度為0(空白對(duì)照)、5、10ng/ml中培養(yǎng)24h后，檢測(cè)各組細(xì)胞中p62在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量，組間比較結(jié)果提示，mRNA相對(duì)表達(dá)量不全相同(F=29.318、P=0.001)，3組間兩兩比較結(jié)果提示,mRNA表達(dá)水平從小到大依次為0ng/ml組、5ng/ml組、10ng/ml組，0ng/ml組與5ng/ml組比較、0ng/ml組與10ng/ml組比較、5ng/ml組與10ng/ml組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.004、0.000、0.025，詳見(jiàn)圖4。

圖4 3種濃度SIS3對(duì)SiHa細(xì)胞p62mRNA表達(dá)水平的影響

4.SIS3影響宮頸癌SiHa細(xì)胞中p62的蛋白表達(dá)水平：對(duì)圖5的結(jié)果進(jìn)行灰度值掃描后，以p62相對(duì)β-actin的灰度值比作為p62的相對(duì)表達(dá)量，0ng/ml組(空白對(duì)照)、5ng/ml組、10ng/ml組的p62相對(duì)表達(dá)量分別為0.911±0.086、1.819±0.337、2.352±0.265，組間比較蛋白相對(duì)表達(dá)量不全相同(F=25.001、P=0.001)，3個(gè)組的兩兩比較結(jié)果顯示,蛋白表達(dá)水平從小到大依次為0ng/ml組、5ng/ml組、10ng/ml組，0ng/ml組與5ng/ml組比較、0ng/ml組與10ng/ml組比較、5ng/ml組與10ng/ml組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.005、0.000和0.041，詳見(jiàn)圖6。

圖5 3種濃度SIS3對(duì)SiHa細(xì)胞p62蛋白表達(dá)水平的影響

圖6 3種濃度SIS3對(duì)SiHa細(xì)胞p62蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

自噬是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad4信號(hào)通路是自噬的重要通路之一。在宮頸癌中可顯示TGF-β1/ Smad4信號(hào)通路的失調(diào)。TGF-β1對(duì)正常宮頸上皮細(xì)胞有強(qiáng)效的抑癌作用，隨著宮頸癌的發(fā)展，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)換對(duì)TGF-β的反應(yīng)，并利用該因子作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞維持的有效啟動(dòng)子。Chen等[5]研究指出，與健康對(duì)照組比較，在大約71.21%的宮頸癌患者血漿中檢測(cè)到TGF-β1高表達(dá)。此外，在一些晚期宮頸癌中，TGF-β1水平與臨床病理特征如腫瘤大小、侵襲性和低分化呈正相關(guān)[6]。Smad4的低表達(dá)是宮頸癌中最常見(jiàn)的改變之一，由缺失、突變或表觀遺傳修飾引起。有文獻(xiàn)報(bào)道，異位表達(dá)的Smad4誘導(dǎo)了SiHa細(xì)胞凋亡，并降低了裸鼠宮頸癌的生長(zhǎng)，表明Smad4在腫瘤中具有抑癌作用[7]。Phuah等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-210的抑制增加了Smad4蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)宮頸癌的抗增殖和凋亡誘導(dǎo)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明Smad4在TGF-β介導(dǎo)的腫瘤抑制中起著核心作用。SIS3是一種合成化學(xué)物質(zhì)，能特異性抑制Smad3磷酸化及其與Smad4的結(jié)合，并降低TGF-β1的蛋白水平，因此可作為T(mén)GF-β1/Smad4通路抑制劑[9]。

研究顯示，自噬在癌變的早期階段起著抑癌作用，可能是通過(guò)抑制其對(duì)活性氧的產(chǎn)生和促炎性細(xì)胞因子分泌的抑制作用。在晚期自噬通過(guò)增加在弱氧條件下的癌細(xì)胞存活來(lái)促進(jìn)已建立腫瘤中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10,11]。自噬和TGF-β1/Smad4通路均廣泛參與腫瘤代謝[12]。Zhang等[13]研究表明，自噬和TGF-β1/Smad4途徑均參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲，而且自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白和TGF-β都被確定與病理等級(jí)相關(guān)。Smad4作為T(mén)GF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成員，在激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮抑制作用。細(xì)胞自噬功能的不穩(wěn)定性與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HPV感染可抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[14]。p62是與自噬通量有關(guān)的中樞自噬相關(guān)基因，研究表明，p62的數(shù)量上調(diào)和無(wú)效降解與多種癌癥(包括宮頸癌)的發(fā)生有關(guān)，p62水平的升高可能表明自噬降低不足以降解p62，同時(shí)有利于癌細(xì)胞突破基膜，導(dǎo)致了腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[4]。

本研究通過(guò)給予TGF-β1濃度為0(空白對(duì)照)、5、10ng/ml干預(yù)宮頸癌SiHa細(xì)胞24h后，p62表達(dá)量較對(duì)照組逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，通過(guò)給予SIS3濃度為0(空白對(duì)照)、5、10ng/ml干預(yù)SiHa細(xì)胞24h，p62表達(dá)量較對(duì)照組逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示TGF-β1/Smad4通路通過(guò)調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而影響宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。Liang等[15]研究表明，TGF-β1通過(guò)TGF-β1/Smad4依賴性途徑誘導(dǎo)自噬。在用濃度梯度TGF-β1處理了24h胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中，LC3的表達(dá)量逐漸增高。分別用2ng/ml和5ng/ml TGF-β1處理24h的胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞，透射電子顯微鏡顯示隨濃度升高胞質(zhì)中自噬體增加。提示TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad4通路激活了自噬并且影響了下游的LC3表達(dá)量。而在胃癌等腸道腫瘤中也有類似發(fā)現(xiàn)[16]。上述結(jié)論均與本研究結(jié)果相符，此研究發(fā)現(xiàn)可能為預(yù)防和治療宮頸癌提供新的思路。

綜上所述，外源性的TGF-β1 /Smad4通路激活劑TGF-β1可使宮頸癌SiHa細(xì)胞自噬蛋白p62 mRNA及蛋白的表達(dá)量降低，誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞發(fā)生自噬，細(xì)胞侵襲和遷移能力可能增強(qiáng)。外源性的TGF-β1/Smad4通路抑制劑SIS3可使宮頸癌SiHa細(xì)胞自噬蛋白p62 mRNA及蛋白的表達(dá)量升高，抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞發(fā)生自噬，細(xì)胞侵襲和遷移能力可能減弱，且隨TGF-β1和SIS3濃度的增加，p62表達(dá)量出現(xiàn)變化，具有一定的濃度依賴性。本研究提示調(diào)控TGF-β1/Smad4通路可對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞自噬基因p62產(chǎn)生影響，意義在于闡明TGF-β1/Smad4通路與自噬關(guān)鍵基因在宮頸癌中的相關(guān)性，以提供對(duì)宮頸癌潛在機(jī)制的深入探討。