董 競 吳 鈴 趙激浪 歐陽杰 凡 永 呂祁峰 李孟惠 李 斌

進行體外授精時，受精及早期胚胎質量將直接影響不孕癥患者的治療結局。常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)操作中，卵丘-卵母細胞復合物(cumulus-oocyte complex, COC)將直接與數(shù)量合適的精子進行共同孵育過夜，第2天去除卵丘細胞后觀察原核形成及早期胚胎發(fā)育情況[1]。在這個過程中，因延長了精卵共同孵育的時間，死亡的精子及受精過程中大量散落的卵丘細胞可能會產(chǎn)生一些不利于早期胚胎發(fā)育的物質，如氧化自由基等，從而影響體外胚胎的發(fā)育[2]。此外，過多的精子和卵丘細胞也會大量消耗掉培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，從而對早期的胚胎造成不良的影響。短時授精研究發(fā)現(xiàn)，縮短精卵共育的時間不會影響受精率，可提高胚胎發(fā)育質量[3～5]。但有研究認為，卵母細胞過早的脫離卵丘細胞存在的微環(huán)境會對其成熟、受精產(chǎn)生不利的影響，保留卵丘細胞能夠增加卵子受精后的胚胎發(fā)育能力，提高胚胎利用率和臨床妊娠率[2，6]。現(xiàn)有研究多集中在通過減少精卵共育的時間來改善臨床結局，但IVF授精時，卵丘顆粒細胞存在的密度對胚胎學結局的影響尚未引起關注。本研究旨在探討傳統(tǒng)IVF授精時，COC上卵丘顆粒細胞密度對胚胎學結局的影響。本文將通過受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率、卵子利用率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等多種指標來評價IVF授精時，卵丘細胞的多寡對胚胎學和胚胎移植結局的影響。

對象與方法

1.研究對象：回顧性分析2016年11月～2017年5月(對照組)和2017年11月～2018年5月(研究組)在上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科接受體外受精-胚胎移植治療的不孕癥患者710例?；颊呒{入標準：首次IVF周期患者；年齡≤35歲；基礎卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)<10IU/L；竇卵泡數(shù)≥5個；獲卵數(shù)≤15個。排除標準：嚴重的內外科系統(tǒng)性疾病不適宜接受促排卵治療及不能耐受妊娠患者；有高泌乳素血癥及產(chǎn)生高雄激素的其他內分泌疾病，如卵巢和腎上腺腫瘤等。對照組按照1∶1與研究組根據(jù)年齡、不孕年限和體重指數(shù)等患者基本資料進行傾向得分匹配[7]。本研究嚴格遵守《赫爾辛基宣言》并得到醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會的審批，參與對象均簽署知情同意書。

2.超促排卵及取卵：按本中心孕激素促排卵方案進行促排[8]。從月經(jīng)周期的第3～5天開始促排，在促排7～8天后，陰道超聲監(jiān)測卵泡的發(fā)育情況，并進行性激素水平的測定，根據(jù)卵泡的發(fā)育情況及血清中的激素水平，調整用藥量，當有1個以上卵泡的直徑達到20mm或者3個以上的卵泡直徑達到18mm以上時扳機，扳機34～36h后在陰道超聲引導下行取卵術。

3.剝除卵丘細胞：先用巴斯德管將取到的COCs在2ml G-IVF(瑞典Vitrolife公司)中洗去殘留紅細胞，隨后轉入含1ml G-IVF的Falcon 353037培養(yǎng)皿(美國Corning公司)中，置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育3～4h。授精操作前，先在無菌大皿Falcon 353003中做一個200μl G-IVF的液滴，再將待切除卵丘顆粒細胞的COCs轉入液滴中(≤5個COCs)，用1ml BD注射器在COC周圍呈井字形切割4下(圖1)，切除卵母細胞周圍約80%的卵丘顆粒細胞后，隨后將處理好的COC轉入含1ml G-IVF的Falcon 353037培養(yǎng)皿中，等待加精。重復上述操作，將所有需要切除卵丘顆粒細胞的COCs處理完畢。上述所有操作均是在37℃，6% CO2的操作箱(美國Astec公司, ss-250)中進行。

圖1 卵丘顆粒細胞部分去除前后的比較(×4)A.顆粒細胞部分去除前；B.顆粒細胞部分去除后；C.切卵丘示意圖

4.精液處理與體外受精：男方取卵日手淫法取精，密度梯度離心聯(lián)合上游法優(yōu)化處理精液，隨后將精子置入37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內孵育備用。取卵后3～4h，去除和未去除部分卵丘顆粒細胞的卵子行常規(guī)IVF授精。COC均置于盛有1ml G-IVF的Falcon 353037培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)密度梯度離心后優(yōu)選的精子，孵育過夜后，觀察原核。

5.胚胎培養(yǎng)與觀察：授精后約16～18h觀察受精情況，72h觀察胚胎卵裂情況。采用Cummins′標準對第3天胚胎進行評級[9]。其中Ⅰ級和Ⅱ級胚胎作為優(yōu)質胚胎進行冷凍保存；Ⅲ級和Ⅳ級胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期。囊胚采用Gardner和Schoolcraft評分系統(tǒng)進行評級。在第5天或第6天，只有3BC級或更高級別的胚胎被冷凍，而囊胚在第7天至少達到3CC才有資格被冷凍。胚胎冷凍根據(jù)既有方法采用Cryotop進行[10]。

6.胚胎移植與妊娠結果判斷：筆者所在中心常規(guī)采用凍融胚胎移植(FET),胚胎移植的內膜準備主要有自然周期、微刺激和激素替代3種方式，均按筆者所在中心常規(guī)進行[11]。胚胎移植操作均在超聲監(jiān)測下進行，移植后14天行尿hCG檢測，陽性為生化妊娠，再經(jīng)14天行陰道超聲檢查，見孕囊者為臨床妊娠。

結 果

1.患者基本資料：經(jīng)過傾向得分匹配后共入選710個周期，研究組和對照組各355個周期。兩組患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎FSH、基礎LH、不孕原因和平均獲卵數(shù)等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 患者的基本資料

2.IVF治療時降低卵丘顆粒細胞密度對患者受精和胚胎發(fā)育的影響:研究組的受精率、正常受精率、有效成囊率和卵子利用率均高于對照組相應指標(P<0.01)，異常受精率則低于對照組(P<0.01)。兩組間卵裂率和優(yōu)胚率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組患者受精和胚胎發(fā)育的比較[%(n/N)]

3.IVF治療時不同COC授精密度下卵丘顆粒細胞密度對胚胎學結局的影響：研究組(切除COC上部分卵丘顆粒細胞)中按授精卵數(shù)分為低密度(1～5個)、中密度(6～10個)和高密度(11～15個)3組分別與對照組相應授精卵密度的患者進行比較，以分析不同授精密度情況下卵丘顆粒細胞密度對受精和胚胎發(fā)育的影響。3個授精密度組內，研究組和對照組患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎FSH、基礎LH、不孕原因和平均獲卵數(shù)等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

項目低密度(1～5個)中密度(6～10個)高密度(11～15個)對照組研究組對照組研究組對照組研究組周期數(shù)7979153153123123年齡(歲)32.56±2.1932.00±2.0632.09±2.2231.87±2.5231.60±2.1331.59±2.44不孕年限(年)3.80±2.353.14±1.933.15±2.013.23±1.893.03±1.663.53±2.01體重指數(shù)(kg/m2)22.28±3.7022.66±4.0421.86±3.2422.39±3.4021.59±2.7821.72±2.74基礎FSH(IU/L)6.21±1.755.76±1.415.57±1.305.77±1.205.45±1.115.42±1.03基礎LH(IU/L)3.37±2.213.93±3.083.65±2.074.04±2.133.96±2.144.05±2.26不孕原因 輸卵管因素41(51.90)44(55.70)96(62.75)108(70.59)75(60.98)88(71.54) 排卵障礙4(5.06)2(2.53)3(1.96)2(1.31)5(4.07)7(5.69) 子宮內膜異位癥4(5.06)3(3.80)9(5.88)6(3.92)01(0.81) 混合因素26(32.91)28(35.44)36(23.53)31(20.26)37(30.08)21(17.07) 不明原因4(5.06)2(2.53)9(5.88)6(3.92)6(4.88)6(4.88)獲卵數(shù)3.46±1.343.48±1.438.16±1.368.03±1.3412.81±1.4412.81±1.33

當COC授精密度≤5個時，研究組和對照組之間受精率、正常受精率、異常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、有效成囊率和卵子利用率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當COC授精密度>5個時，研究組的正常受精率、有效成囊率和卵子利用率顯著高于對照組(P<0.05)，異常受精率顯著低于對照組(P<0.05)，其中當COC授精密度>10個時，研究組的受精率、正常受精率、異常受精率、有效成囊率和卵子利用率與對照組的比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表4。

表4 不同授精密度情況下兩組患者受精和胚胎發(fā)育的比較[%(n/N)]

4.IVF治療時降低卵丘顆粒細胞密度對患者胚胎移植結局的影響:研究組和對照組分別進行了449和387個FET周期，研究組和對照組的生化妊娠率、臨床妊娠率、宮外孕率、流產(chǎn)率、種植率、活產(chǎn)率、繼續(xù)妊娠率等比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；研究組的新生兒孕周、出生體重和出生缺陷率與對照組相似，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表5。

表5 兩組患者FET結果的比較

討 論

隨著輔助生殖技術的發(fā)展，人們不斷探索如何改進實驗方法以獲取更高的受精率、更優(yōu)質的胚胎及更高的臨床妊娠率。本研究旨在了解IVF治療時卵丘顆粒細胞存在的密度對早期胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)在IVF授精前通過切除部分卵丘顆粒細胞降低其密度可顯著提高卵子的正常受精率、降低異常受精率，改善早期胚胎質量，增加患者卵子利用率，而對胚胎移植結果沒有明顯影響。

卵丘顆粒細胞可分泌雌二醇(estradiol, E2)及孕酮(progesterone, P4)，常規(guī)IVF受精過程中大量顆粒細胞產(chǎn)生的高水平的E2、P4對胚胎具有直接的毒性作用[12，13]。卵丘顆粒細胞還可產(chǎn)生大量的活性氧類物質(reactiveoxygenspecies, ROS)，引起細胞膜流動性降低，促使DNA碎片形成和胚胎發(fā)育停止，導致透明帶硬化，影響胚胎正常孵出，降低胚胎的生存能力[14，15]。此外體外培養(yǎng)過程中大量顆粒細胞也會消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，使卵子處于一個相對營養(yǎng)不足的環(huán)境中。為減少卵丘顆粒細胞代謝產(chǎn)物對卵子及受精卵可能產(chǎn)生的負面影響，本研究在授精前切除過多的顆粒細胞以降低其密度，在保證受精時間的同時，降低卵子、受精卵周圍不良代謝產(chǎn)物的濃度，減少對授精液營養(yǎng)成分的消耗。Gianaroli等[3]研究發(fā)現(xiàn)，減少COC暴露于授精液中的時間后，受精率和種植率都顯著提高，表明減少COC暴露于授精液中的時間有利于胚胎發(fā)育。

多項研究認為短時受精有利于胚胎質量及種植潛能的提高，是減少了卵丘或精子代謝廢物對卵子產(chǎn)生的潛在損害，這與本研究有異曲同工之效[16～18]。但是史鴻志等[19]研究發(fā)現(xiàn)，過夜受精在受精率、優(yōu)質胚胎率等指標上甚至優(yōu)于短時受精聯(lián)合補救ICSI，因為過夜受精減少了體外操作和暴露時間，一些卵母細胞在過夜培養(yǎng)過程中胞質和胞核達到了更好的成熟狀態(tài)，且在一個合適的受精濃度范圍內，精卵作用時間的延長并不產(chǎn)生負面的影響，反而為卵母細胞提供了更多的優(yōu)質精子選擇。本研究通過在授精前切除COC上部分卵丘顆粒細胞以降低其密度的方法，讓卵子在過夜受精的同時又減少了卵丘顆粒細胞代謝廢物對卵子產(chǎn)生的潛在損害，研究結果證明了此授精方案的有效性，未來將需進一步擴大樣本量，并進行隨機對照研究來探索授精前切除部分顆粒細胞對卵子受精和胚胎發(fā)育的影響。

既然授精過程中卵丘顆粒細胞產(chǎn)生的代謝廢物會影響受精和胚胎發(fā)育，那么IVF授精時授精皿中不同的COC密度就會造成卵丘顆粒細胞密度的不同，可能會影響卵子受精和胚胎發(fā)育。因此本研究將入組患者按照IVF授精時授精皿內卵子數(shù)分組，分析不同授精密度下不同卵丘顆粒細胞密度對受精結果和早期胚胎發(fā)育的影響。本研究結果顯示，當COC授精密度≤5個時，研究組和對照組之間受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、有效成囊率和卵子利用率比較，差異均無統(tǒng)計學意義。結果與劉曉妍等[20]研究結果一致，該研究發(fā)現(xiàn)，當授精密度為1～4個卵子時，授精前剝除部分卵丘細胞不會影響IVF的受精結局；當COC授精密度>5個以后，研究組的正常受精率、有效成囊率和卵子利用率均顯著高于對照組的相應指標，異常受精率也顯著低于對照組；當COC授精密度>10個時，研究組的受精率、正常受精率、異常受精率、有效成囊率和卵子利用率與對照組的差異愈加顯著(P<0.01)。結果表明，卵丘顆粒細胞的高密度存在可能產(chǎn)生了有害的代謝物質影響了受精和胚胎發(fā)育，通過切除COC上部分卵丘顆粒細胞降低其密度后，能有效改善胚胎學結局，同時這種改善作用隨著授精密度增加更加顯著。

IVF治療的臨床結局是醫(yī)患共同關心的問題。本研究發(fā)現(xiàn)研究組和對照組的生化妊娠率、臨床妊娠率、宮外孕率、流產(chǎn)率、種植率和活產(chǎn)率等比較，差異均無統(tǒng)計學意義，兩組的新生兒孕周、出生體重和出生缺陷率也相似，說明IVF授精過程中降低卵子周圍顆粒細胞的密度不會對胚胎移植結局造成影響。

本研究未全部剝除而只是部分切除卵丘顆粒細胞，是因為卵丘顆粒細胞對卵母細胞與精子結合有重要的調節(jié)作用。研究表明，卵丘顆粒細胞具有參與精子與卵母細胞的相互識別、維持精子運動活力、引導精子到卵母細胞、誘導精子獲能和頂體反應、防止透明帶硬化、提高精子的體外受精等能力。Fatechi等[21]和Li等[22]的研究表明，卵丘顆粒細胞的存在增加卵母細胞的體外受精率、卵裂率和胚胎后續(xù)發(fā)育能力，這說明卵丘顆粒細胞的存在不僅影響精卵結合，而且對卵母細胞的成熟以及受精卵的進一步發(fā)育具有重要的影響。另有研究發(fā)現(xiàn)，全部除去卵丘顆粒細胞的卵母細胞形成雌雄原核的能力受到了損傷，并有較高的多精受精率，提示卵丘顆粒細胞的存在有助于雌雄原核的形成及防止多精受精。

綜上所述，本研究結果表明通過切除COC上的卵丘顆粒細胞以降低其密度，能夠改善患者IVF治療時的胚胎學結局。