吳鵬波 王希君 吳曉曼 陳紅光 譚詩云 夏洪淼

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是一種無過量飲酒史，由各種致病因素導(dǎo)致肝臟以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。目前認為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細胞凋亡、自噬水平紊亂等多種因素參與NAFLD發(fā)展[1～3]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過未折疊蛋白反應(yīng)參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展[4]。肌醇依賴酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，作為細胞未折疊蛋白反應(yīng)重要傳感器，在NAFLD 疾病進程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]?；罨腎RE1α通過多條信號通路促進異常蛋白質(zhì)的降解、保證新生蛋白質(zhì)正確折疊。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IRE1α-JNK信號通路是調(diào)控細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后細胞命運轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。不同NAFLD中細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激強度不同，不同強度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細胞命運轉(zhuǎn)歸影響不同[4]。因此本研究探討IRE1α-JNK通路對早期非酒精性脂肪肝病小鼠模型影響。

材料與方法

1.材料:(1)試劑：高脂飼料自制(高糖高脂飼料組成: 基礎(chǔ)飼料66.5%，蔗糖 10%，豬油20%，膽固醇3.4%，膽酸鈉0.1%)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)均購自南京建成生物工程有限公司；IRE1α、JNK、p-JNK、Bcl-2、caspase-3、Bax、LC3、Beclin-1一抗購自美國Sigma公司；二抗購自武漢三鷹生物有限公司；(2) 動物：SPF級健康雄性C57/BL6小鼠由購自武漢大學動物中心，小鼠6～8周齡，體質(zhì)量20～25g，實驗動物飼養(yǎng)于SPF動物房，室溫20～24℃，相對濕度約40%～60%。(3)主要儀器：石蠟切片機(日本Olympus公司), 普通光學顯微鏡(日本Olympus公司),電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),透射電子顯微鏡(日本Olympus公司)。

2.動物分組及干預(yù)：將C57/BL6小鼠隨機分為對照組、高脂飲食組、IRE1α-shRNA組、慢病毒空白載體組，每組5只；在造模前IRE1α-shRNA組，慢病毒空白載體組小鼠給予腹部肝區(qū)注射IRE1α-shRNA慢病毒載體及慢病毒空白載體100微升/次，連續(xù)3天，適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后進行后續(xù)實驗。對照組給予正常飲食，其余組高糖高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD，飼養(yǎng)3周。

3.HE 染色：實驗結(jié)束后處死小鼠獲取肝組織組織放入10%甲醛溶液中固定72h，石蠟包埋，切片機切4μm厚切片，經(jīng)過脫蠟、脫水、蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色，再經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在倒置顯微鏡下觀察肝組織病變。

4.肝功能及炎性水平檢測：處死小鼠后提心獲取各組小鼠血清，南京建成生物有限公司試劑盒檢測各組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平。

5.電鏡觀察肝組織自噬結(jié)構(gòu)：處死小鼠后獲取肝組織，迅速獲取大小約1mm3肝組織用預(yù)冷的4%戊二醛固定，經(jīng)過PBS充分漂洗后1%餓酸固定，經(jīng)過乙醇及丙酮處理脫水后包埋，采取醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色，最后透射電鏡觀察肝組織內(nèi)自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。

6.Western blot法檢測蛋白表達：處死小鼠后獲取新鮮的肝組織，碾磨并用裂解液裂解，水煮法制作蛋白樣品。蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE分離膠中電泳、轉(zhuǎn)膜、切膜，加入相應(yīng)的一抗孵育過夜，次日早晨加入二抗后孵育2h，顯影定影檢測各目標相對表達。

結(jié) 果

1.IRE1α-JNK通路變化：與對照組比較,高脂飲食組肝組織中IRE1α表達增加，高脂飲食組與空白載體組肝組織中IRE1α表達比較，差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，IRE1α-shRNA組肝組織中IRE1α表達明顯降低。與對照組比較,高脂飲食組肝組織中p-JNK表達增加，高脂飲食組與空白載體組肝組織中p-JNK表達比較，差異無統(tǒng)計學意義；與空白載體組比較，IRE1α-shRNA組肝組織中p-JNK表達明顯降低。結(jié)果提示在造模過程中IRE1α-JNK通路激活，而IRE1α-shRNA慢病毒載體注射可以抑制IRE1α-JNK通路，詳見圖1。

圖1 Western blot法檢測IRE1α-JNK通路變化a.對照組；b.模型組；c.空白載體組；d.IRE1α-shRNA組

2.肝功能及炎性水平：與對照組小鼠比較，模型組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β明顯升高(P均<0.05)；與空白載體組小鼠比較，IRE1α-shRNA組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β明顯升高(P均<0.05)，空白載體組與模型組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β比較，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，詳見圖2。

圖2 各組小鼠肝功能及炎性水平a.對照組;b.模型組;c.空白載體組;d.IRE1α-shRNA組;與對照組比較，*P<0.01;與空白載體組比較， #P<0.05,##P<0.01

3.肝組織病理染色結(jié)果：對照組小鼠肝組織肝小葉結(jié)果正常，細胞無明顯脂肪變性，無炎癥及壞死；模型組和空白載體組可見肝小葉結(jié)構(gòu)尚整齊，可見少量細胞脂肪變性，少許炎性細胞，未見明顯的細胞壞死；與空白載體組比較，IRE1α-shRNA組肝臟組織可見肝小葉輕度紊亂，大量炎性細胞，肝細胞脂肪變性明顯，詳見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織的病理學改變(HE,×200)A.對照組；B.模型組；C.空白載體組；D.IRE1α-shRNA組

4.電鏡觀察自噬結(jié)構(gòu)：對照組肝細胞形態(tài)正常，偶見自噬小體或自噬溶酶體出現(xiàn)；模型組和空白載體組肝細胞出現(xiàn)輕度腫脹，線粒體輕中度空泡化，少許嵴消失，與正常對照組比較，肝細胞內(nèi)自噬小體或自噬溶酶體增加；IRE1α-shRNA組肝細胞中度腫脹，線粒體上述病變加重，肝細胞中鮮見自噬小體或自噬溶酶體結(jié)構(gòu),詳見圖4。

圖4 透射電鏡觀察小鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)(×12000)A.對照組;B.模型組;C.空白載體組;D.IRE1α-shRNA組

5.凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達:與對照組比較, 模型組和空白載體組肝組織內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白無明顯變化，而Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ均明顯增加,P62明顯降低，模型組和空白載體組上述蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義；與空白載體組比較，IRE1α-shRNA組肝組織Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達明顯減少，而Bax、P62、caspase-3表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，詳見圖5。

圖5 Western blot法檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達a.對照組；b.模型組；c.空白載體組；d.IRE1α-shRNA組

討 論

目前國內(nèi)學者認為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在NAFLD發(fā)展中扮演著重要的角色[6,7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)以保護由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細胞損傷，恢復(fù)細胞穩(wěn)態(tài)。近年來發(fā)現(xiàn)不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對NAFLD發(fā)揮不同的作用[4]。在NAFLD早期，短暫(輕度)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激雖然直接誘導(dǎo)細胞凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過啟動自噬等保護機制對抗凋亡，最終細胞即使承受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激，凋亡不會出現(xiàn)明顯增加;而NAFLD晚期，長期(重度)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過一方面可直接誘導(dǎo)細胞凋亡，另一方面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接損傷細胞保護機制直接導(dǎo)致細胞凋亡率明顯增加。IRE1及其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激——非折疊蛋白反應(yīng)因被發(fā)現(xiàn)參與細胞應(yīng)激后細胞存亡抉擇而引起廣泛的關(guān)注[8]。本研究發(fā)現(xiàn)通過注射IRE1α-shRNA慢病毒載體沉默IRE1α-JNK通路發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪變性加重，組織中炎性細胞明顯增加,血清炎性介質(zhì)明顯升高，提示IRE1α-JNK通路對NAFLD具有保護作用。而既往研究提示IRE1α-JNK在NAFLD中扮演有害角色，本研究結(jié)果與既往研究相矛盾[9]。

既往研究NAFLD時，動物模型制作多高脂飲食8周甚至以上[9～11]，而在本研究中動物僅高脂飲食3周。本研究反映IRE1α-JNK對早期NAFLD的作用，而既往的研究是IRE1α-JNK對晚期NAFLD的作用。故本研究與既往研究結(jié)果矛盾可能原因在于早晚期NAFLD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度不同，在NAFLD早期，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過IRE1α-JNK通路通過促進自噬抵抗細胞凋亡扮演有利的角色。凋亡和自噬作為一種維持機體自身穩(wěn)定的基本生理機制,它們分別通過清除損傷、衰老與突變的細胞和降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)等途徑來維持自身的穩(wěn)態(tài)和各種器官及系統(tǒng)的正常功能[12～17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過調(diào)控自噬和細胞凋亡參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)早期NAFLD中IRE1α-JNK通路激活后自噬水平增高，凋亡無明顯增加；抑制IRE1α-JNK通路后自噬水平降低，凋亡明顯增加。

綜上所述，IRE1α-JNK通路可能通過促進自噬對早期NAFLD起保護作用，然而IRE1α-JNK通路信號如何通路調(diào)控自噬有待于進一步探索。明確IRE1α-JNK通路在NAFLD中自噬調(diào)控的具體作用機制，將有利揭示自噬NAFLD中鮮為人知的一面，為NAFLD臨床治療及預(yù)防提供新的思路。