*何文勝，程偉青，陳 忠

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建，福州350007；2.福建省微生物研究所，福建，福州350007）

依魯替尼（Ibrutinib，也稱伊布替尼）是一種罕見侵襲性血癌——套細胞淋巴瘤（MCL）[1-4]的治療藥，美國FDA 授予其突破性治療藥物資格，是突破性藥物+優(yōu)先審評+加速批準+孤兒藥，于2013年11月13日由FDA 加速批準上市（Pharmacyclics公司和Johnson &Johnson 公司）。2015年1 月，其新的適應(yīng)癥被擴大至非霍奇金淋巴瘤——巨球蛋白血癥（WM）的治療，成為首個治療該疾病的藥物，2017年8月該專利藥在我國正式獲批上市（億珂），價格昂貴約3萬元人民幣/月。目前，孟加拉生產(chǎn)的依魯替尼是全球唯一獲得政府監(jiān)管機構(gòu)批準合法生產(chǎn)的仿制藥。由于專利保護，我國還不能合法生產(chǎn)該藥，但鑒于該藥對治療MCL的優(yōu)異表現(xiàn)，我國學(xué)者對依魯替尼的合成研究表現(xiàn)出極大的關(guān)注[5-6]。由于合成路徑不同，各自所用的有機溶劑也不同。本課題組在依魯替尼合成過程[7]中用到的有機溶劑主要有異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、DMF 等。

為保證用藥安全，《中國藥典》和《藥品注冊的國際技術(shù)要求》對各有機溶劑的限量均有規(guī)定。藥品殘留溶劑的檢測方法有多種[8-9]，如干燥失重測定法快速簡便，但一般只能測定溶劑殘留的總量，專屬性較差；分光光度法通過不同溶劑的特征吸收峰值強度的差異來檢測藥物中殘留溶劑，靈敏度較低。易揮發(fā)物質(zhì)一般采用氣相色譜法[10-11]，而頂空氣相色譜法（HS-GC）是許多國家藥典檢測藥品有機殘留溶劑的首選方法[12]，該技術(shù)前處理步驟簡單，將固態(tài)或液態(tài)樣品中的揮發(fā)性組分加熱揮發(fā)后，直接導(dǎo)入氣相色譜儀進行分離和檢測，且頂空進樣體積大于直接手動進樣體積，靈敏度得到了大幅的提高。鑒于此，本研究中參考了相關(guān)文獻，建立了HS-GC測定本課題組合成依魯替尼原料藥中殘留溶劑量的方法，快速、簡便，結(jié)果準確可靠，以期為依魯替尼原料藥的質(zhì)量控制及監(jiān)測提供質(zhì)控基礎(chǔ)。同時，也為其他藥品合成中使用異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、DMF 作為溶劑的藥品，進行有機殘留溶劑檢測提供參考借鑒。

1 儀器與試劑

Agilent7820A 氣相色譜儀，配FID檢測器、Agilent7697A 頂空自動進樣器；載氣為高純氮（99.999%），Agilent GC ChemStation 色譜工作站；電子天平（METTLER AE240，十萬分之一）。Milli-Q超純水儀。

依魯替尼原料藥為藥化研究室自制（批號：EBR031116，EBR031118，EBR031120）。二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、N、N-二甲基乙酰胺(DMA)、DMF、異丙醇均為色譜純（純度＞99.8%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:DB-624（30m×530μm×3μm，美國Agilent 公司）；升溫程序：初始溫度40 ℃（3 min），升溫至70 ℃（10 /min℃ ），70 ℃（2 min），升溫至200 ℃（20 /min℃ ），200 ℃（5 min）；檢測器：FID（300℃）；載氣：氮氣；柱流速5 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流方式進樣；分流比：8:1；頂空平衡溫度：110 ℃，平衡時間：30 min；進樣量：1 mL。

2.2 溶液的制備

對照儲備液的制備：分別精密稱取5000 mg 異丙醇、600 mg 二氯甲烷、5000 mg 乙酸乙酯、720 mg四氫呋喃、890 mg 甲苯、880mgDMF，置于同一100 mL 容量瓶中，DMA 定容至刻度，即得（4 ℃保存）。

系列對照品溶液的制備：分別精密移取對照儲備液適量，稀釋，即得。

供試品溶液的制備：稱取依魯替尼原料藥樣品約0.5 g，精密稱定，置于頂空瓶（20 mL）中，加入DMA 5 mL 溶解，密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下方法配制對照品溶液、溶劑空白液，按“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖（圖1）。空白溶劑不干擾各殘留溶劑的檢測，且各殘留溶劑的分離度>1.5，滿足檢測要求。

圖1 專屬性試驗氣相色譜圖Fig.1 GC chromatograms

2.4 線性范圍、定量限、檢測限

取“2.2”項下的系列對照品溶液，按“2.1”項下方法測定。以溶劑的質(zhì)量濃度（X, μg/mL）為橫坐標，對應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。6種溶劑的線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.998。各溶劑的檢測限（S/N=3）、定量限（S/N=10)結(jié)果見表1。

表1 6種殘留溶劑的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Table 1 Equations of linear range，correlation coefficients，LOD and LOQ of 6 residual solvents

2.5 精密度

精密量取“2.2”項下對照品混合溶液5 mL，按“2.1”項下方法測定，平行6 份，計算RSD。各有機殘留溶劑異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯和DMF的峰面積的RSD分別為2.2%，1.8%，1.9%，1.8%，2.0%，2.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性

精密稱取樣品（批號：EBR031116）0.5 g，平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下方法測定，計算RSD。異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯和DMF的RSD分別為2.3%，1.7%，1.9%，1.9%，2.1%，2.0%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 加標回收率試驗

《中國藥典》中異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯和DMF 6種有機殘留溶劑的限值分別為0.5%、0.06%、0.5%、0.072%、0.089%、0.088%。在樣品（批號：EBR031116）中按各有機殘留溶劑限值的80%，100%，120%進行加標試驗，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果(n=3)Table 2 Results of the recovery tests

2.8 樣品的含量測定

取3批樣品（批號：EBR031116，EBR031118，EBR031120）樣品按“2.2”線下方法制備供試品溶液，再按“2.1”頂空氣相色譜條件進樣測試，外標法計算各有機溶劑的殘留量。結(jié)果顯示：3批樣品均未檢出各有機殘留溶劑。

3 討論

3.1 原料藥中殘留溶劑考察的意義

化學(xué)原料藥的合成過程中不可避免會使用各種有機溶劑溶解各種反應(yīng)原料，有時選擇合適的溶劑還可在產(chǎn)品精制過程提高產(chǎn)量、決定藥物的純度、晶型。然而，有機溶劑殘留在藥物中，如果超出安全閾值時，就會對人體產(chǎn)生危害。

本課題組涉及的有機溶劑二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯和DMF均為中國藥典（四部0861）規(guī)定應(yīng)限制使用的二類溶劑，限量規(guī)定分別為0.06%、0.072%、0.089%和0.088%，異丙醇和乙酸乙酯為中國藥典（四部0861）規(guī)定的藥品GMP或其他質(zhì)量要求限制使用的三類溶劑，限量規(guī)定分別為0.5%，因此應(yīng)該對這六類溶劑進行殘留量檢測。

按本方法進行的試驗結(jié)果表明，本課題組在合成工藝過程中所用的有機溶劑均未檢出，滿足《中國藥典》對有機殘留量的規(guī)定。作為該新藥研究質(zhì)量控制的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為藥品將來的生產(chǎn)上市提供有效技術(shù)支持。

3.2 色譜柱的選擇

本次測定的6種有機溶劑極性相差較大，根據(jù)相似相容的原理，選擇非極性色譜柱（DB-1、SE-54）或極性色譜柱（FFAP）均不能使極性待測物或弱極性待測物得到有效分離。選擇中等極性的色譜柱（如DB-624），可最大地兼容各種極性的待測溶劑，使檢測的理論塔板數(shù)（n）、拖尾因子（T）和分離度（R）最優(yōu)化。因此在檢測有機溶劑極性跨度大時，選擇中等極性的色譜柱為宜。

3.3 頂空平衡溫度和平衡時間的選擇

頂空進樣一般將樣品置于密閉容器（頂空瓶），在受控的溫度下加熱，至揮發(fā)性物質(zhì)在氣液兩相中的濃度達到平衡，因此頂空色譜分析的靈敏度和準確度取決于平衡溫度和平衡時間。平衡溫度太低則導(dǎo)致平衡時間長，而且溶劑回收率低；平衡溫度高則會縮短頂空進樣設(shè)備的使用壽命，并可能導(dǎo)致溶劑發(fā)生部分分解。為于兼顧效率和靈敏度，一般選擇被測有機溶劑沸點偏高的溫度作為平衡溫度，如本實驗6種有機溶劑，沸點約在40～153 ℃之間，我們選擇了110 ℃作為平衡溫度；而平衡時間則選擇所有溶劑峰面積增加趨于平緩時即可。