魯友銘，吳勝昔，侯力嘉，王桂玲，馬培杰，盧琬薪

（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

程序性死亡因子配體1（programmed death 1 ligand 1，PD-L1），也稱作 CD274、B7-H1，是 B7家族的新成員［1］。它由人9號(hào)染色體CD274基因編碼而成的I型跨膜蛋白［2］。PD-L1 mRNA有4種轉(zhuǎn)錄形式，其主要形式為4.2 kb，編碼290個(gè)氨基酸［3］。與其受體PD-1相互作用能夠向T淋巴細(xì)胞呈遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，從而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的靜息，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受與免疫逃逸［4］。研究表明PD-L1具有膜型與可溶型兩種存在形式?？扇苄猿绦蛐运劳鲆蜃优潴w1（sPD-L1）主要是由膜型程序性死亡因子配體1（mPD-L1）解離而成，在人機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著與mPD-L1一樣的功能與作用［5］?；罨某墒鞓?shù)突狀細(xì)胞是健康人機(jī)體產(chǎn)生并釋放sPD-L1的主要來(lái)源［6］。除此之外，在惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病患者血清當(dāng)中都能檢測(cè)到高表達(dá)的sPD-L1［7］。有研究表明：晚期胃癌患者血清當(dāng)中sPD-L1蛋白的高低與其癌癥的分化程度、淋巴結(jié)病灶的轉(zhuǎn)移程度及其預(yù)后效果呈正相關(guān)［8］。另外，已有學(xué)者研究表明：在腎透明細(xì)胞癌［9］、乙肝相關(guān)性肝癌［10］、非小細(xì)胞肺癌［11］等多種實(shí)體腫瘤研究中，患者血清當(dāng)中的sPD-L1數(shù)值顯著高于正常人數(shù)值。sPD-L1表達(dá)量的高低在一定程度上與腫瘤分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、腫瘤分化等因素相關(guān)［12］。所以，血清sPD-L1含量的增加很大程度預(yù)示著患者患上述疾病或疾病惡化幾率的增加。目前對(duì)于sPD-L1檢測(cè)來(lái)說(shuō)，其主要檢測(cè)試劑為sPD-L1抗原及其高特異性抗體，然而目前sPD-L1檢測(cè)試劑大多數(shù)依賴進(jìn)口，這類產(chǎn)品價(jià)格昂貴且質(zhì)量參差不齊。因此，制備高純度、具有良好生物活性的sPD-L1蛋白并應(yīng)用于臨床檢測(cè)具有重要意義。本論文采用化學(xué)合成法合成人PD-L1胞外區(qū)基因全長(zhǎng)序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并通過(guò)基因工程方法表達(dá)重組蛋白。為后續(xù)開(kāi)展sPD-L1檢測(cè)方法的研究提供有效試劑。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）由上海唯地生物科技有限公司提供；質(zhì)粒載體pET30a（+）由重慶理工大學(xué)生生物制藥實(shí)驗(yàn)室保存并提供；pET28a（+）-sPD-L1重組質(zhì)粒、pET28a（+）-sPD-L1/DH5α甘油菌由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并提供。

1.2 主要試劑及儀器

卡那霉素（Kanamycin）、IPTG，PMSF購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司；5×Loading buffer購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Monoclonal anti-HISTag antibody購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；Nco I、Xhol I、10×Q.Cut.G.Buffer購(gòu)自TAKARA生物技術(shù)（北京）有限公司。MULTISKAN GO購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；NGCTMChromatography System、Bio-ScaleTM親和層析Ni柱均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.3 序列分析、合成

根據(jù)GenBank發(fā)布的人源PD-L1基因序列（GenBank登錄號(hào)：AY254342.1），對(duì)序列分析后進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，使其適合于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，質(zhì)粒載體選擇pET28a（+），并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并構(gòu)建。

1.4 pET28a（+）-sPD-L1重組質(zhì)粒載體的酶切鑒定

使用接種環(huán)蘸取含有pET28a（+）-sPD-L1重組質(zhì)粒的DH5α甘油菌，在含有卡那霉素抗性LB平板上劃線接菌，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。次日于平板上蘸取大而飽滿的單菌落，接種于含有卡那霉素抗性的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃，180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12～16 h，至OD600值達(dá)到0.6～0.8，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取。將提取出的質(zhì)粒利用Nco I、Xhol I限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系如表1所示。

表1 雙酶切體系

37℃水浴條件下酶切1 h，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.5 重組載體的轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的保菌工作

將重組質(zhì)粒pET28a（+）-sPD-L1通過(guò)熱激法導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作步驟參考文獻(xiàn)［13］。將轉(zhuǎn)化后的 pET28a（+）-sPDL1/BL21（DE3）進(jìn)行菌種保藏，具體操作如下：挑取過(guò)夜培養(yǎng)平板中大而飽滿的單菌落，接種至5 mL卡那霉素抗性LB試管中，37℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)到0.8時(shí)，吸取500μL菌液與500μL的40%滅菌甘油于1.5 mL EP管中，置于-80℃超低溫冰箱中進(jìn)行保藏。

1.6 p ET28a（+）-sPD-L1重組蛋白的表達(dá)與鑒定

從-80℃超低溫冰箱中取出pET28a（+）-sPDL1/BL21（DE3）菌液，通過(guò)平板劃線使其在具有卡那霉素抗性的LB平板中長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落于5 mL卡那抗性LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.8時(shí)，加入適量的IPTG，于37℃誘導(dǎo)數(shù)小時(shí)，然后取誘導(dǎo)之后的菌液進(jìn)行離心，取上清以及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳的鑒定?？蛰d體對(duì)照［pET30a（+）-BL21（DE3）］按照同樣的條件進(jìn)行處理。

1.7 p ET28a（+）-sPD-L1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件篩選

將pET28a（+）-sPD-L1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種于5 mL抗性試管中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.8。將各培養(yǎng)管按IPTG濃度梯度（0.1、0.5、1 mmol/L）、溫度梯度（16、25、37℃）以及時(shí)間梯度（6、9、12 h）進(jìn)行誘導(dǎo)篩選。利用SDSPAGE電泳對(duì)樣品進(jìn)行鑒定從而分析其最佳誘導(dǎo)條件。

1.8 p ET28a（+）-sPD-L1蛋白的大量表達(dá)及純化

將5 mL試管中的菌液吸取2 mL于200 mL含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，按照篩選好的條件，將重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。

1.8.1 重組蛋白 pET28a（+）-sPD-L1包涵體的收集與溶解

pET28a（+）-sPD-L1/BL21（DE3）菌株經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)菌液進(jìn)行低溫離心。棄去上清液（LB液體培養(yǎng)基），對(duì)菌體沉淀進(jìn)行稱重；然后以1×PBS：菌體濕重=35∶1的比例加入1×PBS洗滌液，洗滌菌體細(xì)胞，10 000 r/min離心10 min；再用1×PBS重復(fù)洗滌一次。離心后留菌體沉淀。

利用緩沖液 A（50 mM Tris-HCl［pH8.5］，100 mM NaCl，1%Triton X-100）對(duì)菌體沉淀進(jìn)行重懸，加入0.2 mg/mL的溶菌酶，置于37℃搖床緩慢反應(yīng)20min，加入1%PMSF超聲破碎。13 000 r/min離心10 min，棄上清，收集包涵體沉淀。

分別用緩沖液 B（50Mm Tris-Hcl［pH8.5］，100mM NaCl，1%Triton X-100，2M Urea），緩沖液 C（50Mm Tris-HCl［pH8.5］，100mM NaCl，1%Triton X-100），緩沖液 D（50Mm Tris-Hcl［pH8.5］，100mM Nacl，1%Triton X-100，2M鹽酸胍）超聲清洗包涵體沉淀。13 000 r/min離心10 min收集沉淀。

用緩沖液 E（50Mm Tris-HCl［pH8.5］，100mM NaCl，10mM DTT，2Mm脫氧膽酸鈉，8M Urea）溶解包涵體，緩慢溶解過(guò)夜，次日將溶解產(chǎn)物進(jìn)行離心，13 000 r/min離心10 min。取上清即為包涵體粗提液。

1.8.2 重組蛋白包涵體的純化

用Bio-Rad公司的NGCTMChromatography System對(duì)pET28a（+）-sPD-L1重組蛋白包涵體進(jìn)行親和層析純化。其詳細(xì)操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)［14］。

1.9 重組蛋白 pET28a（+）-sPD-L1的 Western blot鑒定

將純化后的目的蛋白pET28a（+）-sPD-L1進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將目的條帶利用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉；以Monoclonal anti-HISTag antibody為一抗（1∶4 000），4℃孵育過(guò)夜，第2天于水平搖床孵育2 h。將PVDF膜放入TBST中清洗3次，每次10 min。以羊抗鼠IgG-HRP為二抗（1∶4 000）37℃水平搖床孵育1 h，再將PVDF膜放入TBST洗3次，每次10 min，加入顯色液（A液 +B液）孵育5 min，最后用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成影。

1.10 重組蛋白 pET28a（+）-sPD-L1濃度測(cè)定

按照鼎國(guó)昌盛BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定 sPD-L1重組蛋白濃度，具體操作如下：

步驟1 配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液：將BSA標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至 0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0 mg/mL，每個(gè)稀釋度配制20μL；

步驟2 將標(biāo)準(zhǔn)溶液按照濃度從大到小依次加入96孔板中，每孔加入10μL，并加入待測(cè)樣本原液，每孔10μL，每組做3個(gè)平行孔；

步驟3 按照試劑A∶試劑B=50∶1的比列配制適量工作液，每孔加入200μL工作液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；

步驟4 用酶標(biāo)儀測(cè)定 OD562，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算純化后的重組蛋白濃度。

1.11 重組蛋白 pET28a（+）-sPD-L1的透析以及間接ELISA鑒定

將純化后的重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1裝入34MM透析袋（MW：3500）。將透析袋放入1×PBS中4℃透析24 h，重新將透析袋放入新配置的1×PBS中4℃繼續(xù)透析24 h，以除去重組蛋白混合液中的高濃度尿素以及咪唑，為后續(xù)小鼠的安全免疫提供保障。將透析后的重組蛋白以2μg/mL包被進(jìn)行間接 ELISA鑒定，以標(biāo)準(zhǔn)的Monoclonal anti-PD-L1 antibody作為一抗（一抗的稀釋度為1∶1 000～1∶32 768 000），以羊抗鼠 IgGHRP為二抗（1∶4 000），詳細(xì)操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)［13］。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 酶切結(jié)果

將重組質(zhì)粒 pET28a（+）-sPD-L1進(jìn)行雙酶切（Nco I與Xhol I限制性內(nèi)切酶）鑒定。結(jié)果顯示于668 bp處有一條特異性的條帶，如圖1所示。鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，證明重組質(zhì)粒pET28a（+）-sPD-L1構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白 p ET28a（+）-sPD-L1的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

將經(jīng) sPD-L1-pET-28a（+）和 pET30a（+）轉(zhuǎn)化的重組菌株在相同誘導(dǎo)溫度、相同IPTG劑量、相同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液與5×Loading Buffer混勻，煮樣10 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：sPD-L1-pET-28a（+）/BL21（DE3）實(shí)驗(yàn)組在25-35KD處有大量的目的蛋白條帶出現(xiàn)，而空白對(duì)照組pET-30a（+）/BL21（DE3）無(wú)明顯條帶。

2.3 重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1的最佳誘導(dǎo)條件的篩選

設(shè)置了誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及時(shí)間3個(gè)影響因素對(duì)重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1進(jìn)行最佳誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。探索出其最佳誘導(dǎo)條件為：37℃，0.5 mmol/L IPTG，9 h。

1）設(shè)置IPTG的濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，分別設(shè)置16℃、25℃、37℃3組溫度變量，所得菌液經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示。3組溫度變量表達(dá)量相當(dāng)，但為了利于重組蛋白形成包涵體，所以選擇37℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

2）在37℃條件下，設(shè)置了不同的IPTG濃度進(jìn)行相同時(shí)間誘導(dǎo)，所得菌液經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明：重組蛋白在37℃，IPTG誘導(dǎo)濃度分別為 0.5 mmol/L與1 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量相當(dāng)，但是高濃度IPTG對(duì)細(xì)胞有毒副作用，所以最佳IPTG濃度為0.5 mmol/L。

在37℃條件下，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L，設(shè)置了不同的誘導(dǎo)時(shí)間，所得菌液經(jīng)過(guò)SDSPAGE電泳分析，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示重組蛋白的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為9 h。

2.4 重組蛋白 p ET28a（+）-sPD-L1的純化以及SDS-PAGE鑒定

采用鎳柱親和層析的方法對(duì)經(jīng)過(guò)8M Urea變性后的目的蛋白進(jìn)行純化，采用不同濃度的咪唑（50、100、200、400、500 mM）對(duì)目的蛋白進(jìn)行梯度洗脫，收集280 nm紫外吸收峰的洗脫液。結(jié)果顯示：200 mmol/L咪唑可以將目的蛋白全部洗脫下來(lái)。如圖6所示。

將純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖7所示。

2.5 重組蛋白 pET28a（+）-sPD-L1的 Western blot鑒定

Western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組在28 KD左右有一條明顯的蛋白印跡出現(xiàn)（見(jiàn)圖8）。而空載體對(duì)照組則無(wú)條帶，結(jié)果表明重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1純化成功。

2.6 重組蛋白 pET28a（+）-sPD-L1濃度測(cè)定

采用BCA法測(cè)定sPD-L1重組蛋白濃度，測(cè)定結(jié)果如表2所示，利用一元線性回歸方程，得出其回歸方程為：y=0.000 3x-3E-05，R2=0.999 5，表明線性關(guān)系良好，可用于重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1濃度測(cè)定。

表 2 pET28a（+）-sPD-L1濃度測(cè)定結(jié)果

由標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度與標(biāo)準(zhǔn)A562制得BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示。

將待測(cè)樣品OD562代入方程，即可得出樣品蛋白濃度，見(jiàn)表2。

2.7 重組蛋白 p ET28a（+）-sPD-L1的透析以及ELISA鑒定

將純化后的重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1按照上述操作步驟進(jìn)行透析。將透析之后的重組蛋白以2μg/mL包被進(jìn)行間接ELISA鑒定，以標(biāo)準(zhǔn)的Monoclonal anti-PD-L1 antibody作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP為二抗。ELISA結(jié)果顯示：隨著標(biāo)準(zhǔn)的Monoclonal anti-PD-L1 antibody濃度的增加，其OD450讀數(shù)的平均值也隨之上升。當(dāng)抗體濃度達(dá)到62.5 ng/mL時(shí)，純化后的重組蛋白與標(biāo)準(zhǔn)抗體反應(yīng)趨于飽和。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。

3 結(jié)論

1）由于人源sPD-L1蛋白在人體內(nèi)的含量很低，無(wú)法通過(guò)體外提取直接獲得，而化學(xué)合成法直接合成sPD-L1蛋白的成本太高，且質(zhì)量無(wú)法得到保障，本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)以及純化人源sPD-L1，并將其運(yùn)用于癌癥相關(guān)領(lǐng)域的各項(xiàng)檢測(cè)中，具有重要的實(shí)用價(jià)值與研究意義。

2）選擇 pET28a（+）作為表達(dá)載體，因其具有高拷貝、胞內(nèi)表達(dá)等一系列優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)在sPD-L1全長(zhǎng)序列兩端各加了一組His6 Tag。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：兩組His6 Tag在很大程度上提高了蛋白純化效率且對(duì)目的蛋白的免疫原性未造成影響。將純化后的目的蛋白包涵體進(jìn)行透析脫鹽處理，然后進(jìn)行Western blot以及間接ELISA鑒定。鑒定結(jié)果顯示：通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白pET28a（+）-sPD-L1能夠與標(biāo)準(zhǔn)的小鼠 Monoclonal anti-PD-L1 antibody發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，說(shuō)明其具有相同的免疫原性，可用于Balb/c小鼠的免疫，以制備鼠抗人sPD-L1高特異性單克隆抗體。

3）獲取了具有良好生物活性且純度較高的重組sPD-L1蛋白，為后續(xù)鼠抗人sPD-L1單克隆抗體的制備以及sPD-L1檢測(cè)方法的研究提供了良好的試劑。