劉 洋，周晶輝，趙 強，趙士敏，許 崗

(湖南福來格生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 422010)

丙酮酸是生物代謝的重要中間體，丙酮酸及其鹽被越來越廣泛地應(yīng)用于藥物前體、食品添加劑和減肥補充劑等的制備，市場潛力巨大[1-2]。乳酸是制備丙酮酸的重要原料，其價格僅是丙酮酸的10%。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物催化越來越多地運用于丙酮酸的制備[3]。以乳酸為原料生物催化制備丙酮酸的常用酶有乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、乳酸氧化酶(lactate oxidase，LOx)[4-5]。其中LDH需要有NAD+參與反應(yīng)，其價格昂貴，不易于工業(yè)化生產(chǎn)[5]；而LOx作為一種黃素蛋白酶，以黃素核苷酸(FMN)作為輔因子，F(xiàn)MN和酶蛋白牢固結(jié)合，反應(yīng)過程中無需額外添加輔因子，節(jié)約了生產(chǎn)成本[6-7]。因此，以LOx為催化用酶更適合于丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

固定化酶在生產(chǎn)中具有產(chǎn)物易分離、可重復(fù)使用等優(yōu)點，相對于游離酶更具應(yīng)用價值[8-9]。目前，文獻報道的固定化LOx多用于制備檢測微量乳酸的生物傳感器[10-12]，且不具備生產(chǎn)能力；而用于工業(yè)化生產(chǎn)丙酮酸的固定化LOx也未能克服固定化酶穩(wěn)定性差的問題，如劉真等[13]制備的磁性殼聚糖固定化LOx轉(zhuǎn)化5批次后，殘余酶活僅70%；王艷等[14]采用包埋法制備的海藻酸鈣凝膠包埋LOx反應(yīng)5批次后，殘余酶活僅85%。酶的基本性質(zhì)對酶固定化有直接影響。鑒于此，作者首先對LOx游離酶的基本性質(zhì)進行研究，優(yōu)化LOx的固定化條件，并考察固定化LOx的使用穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性，以期為固定化LOx的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 實驗

1.1 菌種與試劑

乳酸氧化酶重組菌Pet-30-avLOx，自行克隆、構(gòu)建并保存。

ECHA/S氨基載體，意大利Resindion S.R.L公司；ES-1環(huán)氧樹脂，天津南開和成科技有限公司；乳酸(含量80%)，河南金丹乳酸科技股份有限公司；過氧化氫酶(0.3 MU·mL-1)，山東泰安信得利生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 LOx的分離純化

1.2.1 發(fā)酵液的制備

挑取保存的E.coliBL21(DE3)/Pet-30-avLOx單菌落接種到含有50 mg·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1搖床過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)液按1.5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有50 mg·L-1卡那霉素的160 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600值約為0.4～0.6，加入1 mmol·L-1IPTG，25 ℃、220 r·min-1過夜誘導(dǎo)表達，即得發(fā)酵液。

1.2.2 LOx的分離純化

將上述發(fā)酵液于4 ℃、5 000 r·min-1離心3 min，收集菌體；用pH值7.5的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液重懸菌體；控制均質(zhì)機壓力800～900 bar，均質(zhì)3次破碎菌體后，于4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，收集上清液；上清液用NI柱純化，10 mmol·L-1咪唑洗滌至無蛋白流后，再用300 mmol·L-1咪唑洗脫；用10 kD超濾膜濃縮脫鹽，即得LOx游離酶。

1.3 LOx的固定化

1.3.1 固定化載體的預(yù)處理

氨基載體活化：將100 g ECHA/S氨基載體用pH值8.0的100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液清洗，真空抽干溶液后，加入400 mL終濃度為5%的戊二醛溶液，維持pH值為7.8～8.2，25 ℃攪拌1 h后真空過濾，再用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液清洗至無戊二醛殘留。

環(huán)氧基載體清洗：用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液清洗ES-1環(huán)氧樹脂至無泡沫產(chǎn)生。

1.3.2 固定化LOx的制備

向LOx游離酶液中加入一定濃度的磷酸氫二鉀溶液，用磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)pH值，按一定投料比(游離酶與載體的比例，U∶g，下同)加入ES-1或ECHA/S載體，攪拌過夜，用pH值7.5的25 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液洗滌5次，即得ES-1固定化LOx、ECHA/S固定化LOx。

1.4 固定化LOx酶活的測定

用0.1 mol·L-1pH值7.5的Tris-HCl緩沖液配制5%乳酸溶液。將40 mL經(jīng)30 ℃預(yù)熱的5%乳酸溶液加入到30 ℃恒溫水浴杯中，加入適量固定化LOx、0.5 mL過氧化氫酶(酶活>20 000 U·mL-1)，0.7 L·min-1通氧反應(yīng)10 min后，取上清液1 mL置于50 mL容量瓶中，采用高效液相色譜測定丙酮酸的生成量。

色譜條件：色譜柱為CenturySIL C18-BDS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)，流動相為0.58%磷酸二氫銨(pH值3.5)-甲醇(100∶5，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長215 nm，柱溫25 ℃，進樣量20 μL。

酶活定義：在30 ℃、pH值7.5的條件下，每分鐘生成1 μmol丙酮酸所需的酶量即為1個酶活單位(U)。比酶活為1 mg酶所具有的酶活單位。

1.5 固定化LOx的使用穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性

在350 mL反應(yīng)體系中加入6%乳酸、6 300 U固定化LOx、5 mL過氧化氫酶、30 μL消泡劑?？刂仆ㄑ趿繛?40 L·h-1、反應(yīng)溫度為30 ℃、pH值為6.8～7.0。每0.5 h取樣，測定丙酮酸生成量和乳酸殘留量。當(dāng)乳酸殘留量小于3 mg·mL-1時，即認為達到反應(yīng)終點。用去離子水將固定化LOx清洗干凈后，進行下一批次反應(yīng)，考察固定化LOx的使用穩(wěn)定性。

分別將1.5 g固定化LOx加入到若干支10 mL滅菌離心管中，于4 ℃儲存，持續(xù)監(jiān)測固定化LOx的儲存穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 LOx游離酶的基本性質(zhì)

2.1.1 pH值穩(wěn)定性

LOx游離酶酶活為688.4 U·mL-1，比酶活為158.5 U·mg-1。不同pH值下，將LOx游離酶于4 ℃儲存45 d，考察其pH值穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，pH值為5時，LOx游離酶的酶活隨儲存時間的延長緩慢下降，儲存45 d后仍保留77%的酶活；其它pH值條件下，儲存45 d后酶活可以保留90%以上。表明，LOx游離酶有較好的pH值穩(wěn)定性。

圖1 LOx游離酶的pH值穩(wěn)定性Fig.1 pH value stability of free LOx

2.1.2 熱穩(wěn)定性

在pH值為7時，將LOx游離酶分別置于35～60 ℃水浴中保溫1 h，考察LOx游離酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 LOx游離酶的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of free LOx

由圖2可知，當(dāng)溫度低于50 ℃時，LOx游離酶的酶活保持穩(wěn)定，無酶活損失；當(dāng)溫度升至60 ℃時，也僅有12%的酶活損失。表明，LOx游離酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2 LOx固定化條件優(yōu)化

2.2.1 載體選擇

向LOx游離酶液中加入終濃度為1 mol·L-1的磷酸氫二鉀溶液，用磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，按投料比4 000∶1加入載體ES-1或ECHA/S，25 ℃攪拌過夜，用pH值7.5的25 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液洗滌5次，測得ECHA/S固定化LOx和ES-1固定化LOx的酶活相差不大，分別為122.60 U·g-1和121.61 U·g-1。4 ℃下，2種固定化LOx的儲存穩(wěn)定性如圖3所示。

由圖3可知，4 ℃下，ES-1固定化LOx的酶活隨儲存時間的延長逐漸降低，77 d后僅保留9%的酶活；而ECHA/S固定化LOx的酶活幾乎沒有損失，77 d后仍保留98%的酶活。表明，ECHA/S氨基載體更適于LOx的固定化。

圖3 固定化LOx的儲存穩(wěn)定性Fig.3 Storage stability of immobilized LOx

2.2.2 投料比選擇

按2.2.1方法，分別按投料比500∶1、1 000∶1、2 000∶1、3 000∶1、4 000∶1、5 000∶1進行固定化，考察投料比對固定化LOx酶活的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 投料比對固定化LOx酶活的影響Fig.4 Effect of material ratio on enzyme activity of immobilized LOx

由圖4可知，當(dāng)投料比為500∶1時，由于載體處于不飽和吸附狀態(tài)，固定化LOx的酶活較低，相對酶活不足50%；隨著酶投加量的增加，載體吸附逐漸趨于飽和，固定化LOx的酶活迅速升高；在投料比達到1 000∶1后，載體處于過飽和吸附狀態(tài)，固定化LOx的酶活隨著酶投加量的增加緩慢升高。因此，選擇投料比為1 000∶1。

2.2.3 磷酸氫二鉀濃度選擇

一般情況下，酶的固定化需要適當(dāng)鹽濃度促進載體與酶分子的表面疏水作用，促使酶分子吸附于載體表面。按2.2.1方法，投料比為1 000∶1，向LOx游離酶液中分別加入終濃度為0 mol·L-1、0.50 mol·L-1、1.00 mol·L-1、1.25 mol·L-1的磷酸氫二鉀溶液，考察磷酸氫二鉀濃度對固定化LOx酶活的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 磷酸氫二鉀濃度對固定化LOx酶活的影響Fig.5 Effect of dipotassium phosphate concentration on enzyme activity of immobilized LOx

由圖5可知，磷酸氫二鉀濃度在0～1.00 mol·L-1時，固定化LOx的酶活無明顯差異；當(dāng)磷酸氫二鉀濃度為1.25 mol·L-1時，固定化LOx的酶活顯著下降。實驗發(fā)現(xiàn)，加入磷酸氫二鉀溶液后酶液瞬間變渾濁，推測為鹽濃度過高導(dǎo)致酶的鹽析。因此，LOx的固定化無需額外增加鹽濃度，這樣可大幅降低下游廢水的處理難度，節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.2.4 固定化溫度選擇

按2.2.1方法，投料比為1 000∶1，分別于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下進行固定化，考察固定化溫度對固定化LOx酶活的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 固定化溫度對固定化LOx酶活的影響Fig.6 Effect of immobilization temperature on enzyme activity of immobilized LOx

由圖6可知，固定化LOx的酶活隨固定化溫度的升高逐漸降低?？赡苁怯捎?，酶的固定化使酶的剛性增加，隨著固定化溫度的升高，酶分子結(jié)構(gòu)逐漸展開，與酶活相關(guān)的一些氨基酸殘基逐漸暴露，從而被載體固定，導(dǎo)致酶活下降；還可能是由于，酶與氨基載體為共價結(jié)合方式，高溫不利于共價鍵的形成[15]。固定化溫度超過30 ℃后，固定化LOx的酶活急劇下降；40 ℃時酶活僅為20 ℃時的28%。因此，選擇固定化溫度為20 ℃。

2.2.5 固定化pH值選擇

按2.2.1方法，投料比為1 000∶1，固定化溫度為20 ℃，調(diào)節(jié)LOx游離酶液pH值分別為6、7、8、9進行固定化，考察固定化pH值對固定化LOx酶活的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 固定化pH值對固定化LOx酶活的影響Fig.7 Effect of immobilization pH value on enzyme activity of immobilized LOx

由圖7可知，固定化pH值對固定化LOx酶活無顯著影響，pH值為7～8時，固定化LOx的酶活稍高，而游離酶pH值正好處于這個范圍。因此，LOx固定化時無需特意調(diào)節(jié)pH值，這樣可以避免pH值調(diào)節(jié)過程中造成酶失活的可能性，從而提高固定化LOx的使用穩(wěn)定性。

綜上，確定LOx的最優(yōu)固定化條件為：使用ECHA/S氨基載體，投料比為1 000∶1，自然鹽濃度，固定化溫度20 ℃，固定化pH值7～8。

2.3 固定化LOx的催化性能及穩(wěn)定性驗證

經(jīng)測定，固定化LOx的丙酮酸摩爾收率約為71%，與游離酶(約70%)相當(dāng)。進行13批次反應(yīng)后，固定化LOx酶活整體保持穩(wěn)定(圖8)，酶活無明顯損失。固定化LOx在4 ℃下儲存60 d和130 d后，相對酶活分別為102%和103%，酶活無損失。表明，制備的固定化LOx具有較好的使用穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

將LOx在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中重組表達，經(jīng)分離純化后得到游離酶，該游離酶具有較好的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。采用ECHA/S氨基載體，在LOx游離酶與載體比例為1 000∶1(U∶g)、自然鹽濃度、固定化溫度為20 ℃、固定化pH值為7～8時，攪拌過夜固定，得到固定化LOx，該固定化LOx具有較好的使用穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化13批次后，酶活無明顯下降；4 ℃下儲存130 d，無酶活損失。該固定化工藝簡單，對設(shè)備要求低，僅需對固定化溫度稍加控制，制備的固定化LOx酶活高、穩(wěn)定性好、可多批次重復(fù)使用，為產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了參考。

圖8 固定化LOx的使用穩(wěn)定性Fig.8 Use stability of immobilized LOx