許妍妍　董宇

摘要 [目的]淺析影響食用油中黃曲霉毒素B1檢測結(jié)果的因素。[方法]根據(jù)國標(biāo)GB 5009.22—2016高效液相色譜柱后光衍生法并優(yōu)化試驗(yàn)條件。[結(jié)果]能力驗(yàn)證樣品中黃曲霉毒素B1含量為3.66 μg/kg，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，采用甲醇水（70+30）溶液提取和3 mL/min 的凈化速率，加標(biāo)回收率為98.7%，RSD為0.73%。通過了中國國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)開展的能力驗(yàn)證《食用油中黃曲霉毒素B1含量的測定》（NIL PT-1637），Z比分?jǐn)?shù)為0。[結(jié)論]能力驗(yàn)證結(jié)果滿意，完善了國標(biāo)測定黃曲霉毒素B1的細(xì)節(jié)操作，為廣大分析測試人員提供參考。

關(guān)鍵詞 黃曲霉毒素B1;能力驗(yàn)證;食用油;高效液相色譜;柱后光衍生

中圖分類號(hào) TS227文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）22-0185-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.049

Proficiency Testing for Determination of Aflatoxin B1 in Cooking Oil

XU Yan-yan，DONG Yu （Kaifeng Institute of Food and Drug Control，Kaifeng，Henan 475000）

Abstract [Objective] To study the influencing factors of detection results for aflatoxin B1 in cooking oil.[Method] According to the high performance liquid chromatography（HPLC） column post-optical derivation method of GB 5009.22-2016 and optimized conditions.[Result]Aflatoxin B1 content in the proficiency testing sample was 3.66 μg/kg，the correlation coefficient was 0.999 9，the extraction rate of methanol water（70+30） solution and the purification rate of 3 mL/min were adopted，the standard recovery rate was 98.7%，and the RSD was 0.73%.The ability verification of Determination of Aflatoxin B1 in Cooking Oil（NIL PT-1637） carried out by CNCA had been passed，the score of Z was 0.[Conclusion]The result of capability verification is satisfactory.This method improves the detailed operations of GB 5009.22-2016 and provides a reference for the majority of analysis testers.

Key words Aflatoxin B1;Proficiency testing;Cooking oil;UPLC;Post-column photochemical derivatization

基金項(xiàng)目 開封市科學(xué)技術(shù)局2020年開封市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2003058）。

作者簡介 許妍妍（1990—），女，山東日照人，助理工程師，碩士，從事食品檢驗(yàn)檢測相關(guān)研究。

收稿日期 2020-04-17;修回日期 2020-06-04

食用油是居民必需脂肪酸的主要攝入來源，我國常見的食用植物油主要有大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、油茶籽油、芝麻油等。由于食用植物油的原料屬性及加工屬性，極易受到黃曲霉毒素的污染[1]。黃曲霉毒素B1有較高的熱穩(wěn)定性，會(huì)引發(fā)突變、致畸和肝損傷，是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種[2]。因此，準(zhǔn)確評價(jià)食用油中黃曲霉毒素B1的含量是食品安全的必然要求。

為提升實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測能力，2018年實(shí)驗(yàn)室參加了中國國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)組織開展的由北京中實(shí)國金國際實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證研究有限公司實(shí)施的NIL PT-1637《食用油中黃曲霉毒素B1含量的測定》能力驗(yàn)證，樣品編號(hào)為122018152018010000。該實(shí)驗(yàn)室報(bào)出結(jié)果為3.66 μg/kg，與組織方統(tǒng)計(jì)平均值一致，Z比分?jǐn)?shù)為0，能力驗(yàn)證結(jié)果滿意。按照國標(biāo)GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》第三法高效液相色譜柱后光衍生法[3]，筆者分析了可能影響食用油中黃曲霉毒素B1含量測定結(jié)果的要點(diǎn)，并對相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。食用油（編號(hào)：122018152018010000），北京中實(shí)國金國際實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證研究有限公司;2 μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所。

1.1.2 試劑。甲醇（色譜級(jí)，迪馬科技有限公司）;乙腈（色譜級(jí)，迪馬科技有限公司）。

1.1.3 儀器。CPA-225D分析天平（德國賽多利斯公司）;Multi Reax 渦旋振蕩器（德國爾夫）;TGL-16離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;黃曲霉毒素B1免疫親和柱（江蘇省蘇微微生物研究有限公司）;E2695液相色譜儀（美國沃特世）;C18色譜柱（美國沃特世）;PHRED-HR光化學(xué)衍生器（北京中科匯仁科技有限公司）。

1.2 方法 參考國標(biāo)GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》第三法高效液相色譜柱后光衍生法進(jìn)行試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)分析，差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.1 樣品制備。通常樣品是指從一批受檢的糧油中按規(guī)定扦取一定數(shù)量具有代表性的部分[4]。為保證樣品均勻性，針對植物油樣品，國標(biāo)中明確規(guī)定，采樣量需大于1 L ，至少采集3個(gè)包裝，將所有樣品在一個(gè)容器中混勻后檢測。樣品取樣量太少，容易影響結(jié)果偏差太大;取樣量過多，可能造成提取過程不完全、超出免疫親和柱柱容量，使結(jié)果產(chǎn)生偏離。此次試驗(yàn)準(zhǔn)確稱量5 g樣品，樣品稱量前應(yīng)充分混勻，并且應(yīng)使樣品溫度穩(wěn)定至室溫。

1.2.2 樣品提取。在100.024 g空白植物油中加入2 μg/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液0.2 mL，搖勻后于陰暗處靜置過夜，作為加標(biāo)樣品（含量3.99 μg/kg）。研究甲醇水（70+30）溶液及乙腈水（84+16）溶液對加標(biāo)樣品中黃曲霉毒素B1的提取效果。

1.2.3 樣品凈化。研究凈化流速對回收率的影響，分別采取1、3、5 mL/min的速度對加標(biāo)樣品進(jìn)行凈化分析。

1.2.4 液相色譜條件。流動(dòng)相為水和乙腈-甲醇（50+50）;進(jìn)樣量50 μL;激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm;選取柱后光衍生器時(shí)，考慮到柱外死體積的大小對色譜圖峰展寬影響很大，在使用細(xì)內(nèi)徑（≤2 mm）高效柱時(shí)尤為突出[5]，因此光衍生器在連接液相色譜儀時(shí)應(yīng)盡可能使儀器管線流路短，死體積少，以提高檢測靈敏度，減少儀器誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱后光衍生器 考慮到柱外死體積效應(yīng)，滿足試驗(yàn)條件前提下盡可能使用內(nèi)徑細(xì)、長度短的管線，以降低色譜圖峰展寬度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品盡可能選擇有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶液應(yīng)與流動(dòng)相一致，以減弱溶劑效應(yīng)，減少因色譜峰形差導(dǎo)致的積分誤差;標(biāo)準(zhǔn)品選擇適宜的標(biāo)準(zhǔn)線性系列，盡可能使待測濃度在線性中間，試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選擇濃度線性范圍為2～6 ng/mL;標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和樣品的移取定容應(yīng)熟練操作，減少操作步驟，定量用到的儀器須經(jīng)校準(zhǔn)后使用，降低標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及稀釋操作引起的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.3 提取 分別采用乙腈水（84+16）溶液和甲醇水（70+30）溶液，經(jīng)渦旋振蕩器渦旋20 min進(jìn)行提取，經(jīng)6 000 r/min 離心10 min后備用，凈化過程中控制濾液以3 mL/min 的速度過柱。加標(biāo)測定結(jié)果回收率分別為98.5%和98.7%，無顯著性差異（P>0.05），見表1。結(jié)合試驗(yàn)成本和溶劑毒性因素，選取甲醇水溶液。

2.4 凈化 試驗(yàn)前應(yīng)將低溫保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫后再用，并驗(yàn)證小柱的柱容量、柱回收率是否合格。樣液上柱、洗柱、毒素洗脫的方法依不同生產(chǎn)廠家產(chǎn)品特性而異，應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。采用不同凈化速度的測定結(jié)果見表2，凈化速率1 mL/min與3 mL/min結(jié)果差異不顯著（P>0.05），凈化速率3 mL/min與5 mL/min的結(jié)果差異顯著（P<0.05）。為保證充分凈化、減少損失，綜合試驗(yàn)時(shí)間成本及結(jié)果，采取控制濾液以3 mL/min的速度過柱。

2.5 能力驗(yàn)證結(jié)果 能力驗(yàn)證樣品經(jīng)甲醇水（70+30）溶液提取，以3 mL/min速度經(jīng)免疫親和柱凈化，按照國標(biāo)GB 5009.22—2016方法檢測，結(jié)果為3.66 μg/kg，RSD為0.73%，檢測結(jié)果與能力驗(yàn)證組織方所出結(jié)果一致，Z比分?jǐn)?shù)為0，能力驗(yàn)證結(jié)果滿意。

3 討論

提高檢驗(yàn)檢測樣品中待測物結(jié)果的正確度需要充分考慮人、機(jī)、料、法、環(huán)各個(gè)環(huán)節(jié)。檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平和儀器設(shè)備的性能對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度均有影響[4]，順利通過此次能力驗(yàn)證不僅說明該實(shí)驗(yàn)室具備相關(guān)的檢驗(yàn)?zāi)芰?，對檢驗(yàn)人員本身也是一個(gè)鍛煉提高的過程。目標(biāo)物質(zhì)提取回收率、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和樣品溶液移取定容等操作環(huán)節(jié)對黃曲霉毒素B1含量的測定結(jié)果都有顯著影響[4]，因此在檢驗(yàn)檢測過程中需要檢驗(yàn)人員熟悉操作過程，嚴(yán)格按照國標(biāo)及儀器設(shè)備說明書中的方法進(jìn)行操作，避免操作誤差提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。黃曲霉毒素B1的稀溶液對紫外光很敏感，遇光易分解，影響測定結(jié)果，因此試驗(yàn)須在光線暗淡的環(huán)境中進(jìn)行，可用棕色玻璃儀器。此外次氯酸鈉、過氧化氫、檸檬酸、二氧化氯、高錳酸鉀及堿等對黃曲霉毒素B1有破壞或降解作用，試驗(yàn)過程中應(yīng)避免接觸上述物質(zhì)，以減少試驗(yàn)誤差[6-9]。黃曲霉毒素B1為強(qiáng)致癌物，操作人員在配制其標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，必須進(jìn)行必要的個(gè)人防護(hù)，試驗(yàn)完畢后仔細(xì)洗手。5%次氯酸鈉可以立即破壞黃曲霉毒素B1，試驗(yàn)后所用容器、廢棄物均應(yīng)用該溶液浸泡30 min以上，防止二次污染。

能力驗(yàn)證是糧油真菌毒素檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段，是衡量糧油真菌毒素檢測結(jié)果可靠性和可比性的常用方法[10]，做好能力驗(yàn)證對實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測能力建設(shè)、服務(wù)市場具有積極意義[11]。

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