張 毓 黃春湲 梁 浩 葉 力 梁冰玉蔣俊俊 陳榮鳳 寧傳藝 廖艷研 黃頡剛

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧市 530021，電子郵箱：503920577@qq.com；2 廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530021；廣西醫(yī)科大學(xué)3 廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，4 生命科學(xué)院，南寧市 530021)

廣西與云南、越南毗鄰，位于毒品販運(yùn)貿(mào)易路上[1-2]，是吸毒人群感染HIV的重點(diǎn)省份之一[3]。目前，阿片類毒品仍是吸毒者使用的主要毒品，占比為39.1%[4]。研究顯示，廣西吸毒人群的HIV感染率在5%以上[5-7]，高于全國平均水平[8]。我國常用非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleoside analog reverse-transcriptase inhibitors,NNRTIs)、核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleoside analog reverse-transcriptase inhibitors,NRTIs)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitors,PIs)進(jìn)行抗病毒治療。盡管抗病毒藥物可以抑制HIV病毒的復(fù)制，延長感染者的壽命，但隨著抗病毒治療藥物的使用增多，其耐藥率逐漸升高[9]。耐藥毒株的傳播，也使得HIV的原發(fā)耐藥率升高。有關(guān)吸毒人群的耐藥情況已有報(bào)道[10-11]，但有關(guān)使用阿片類毒品的HIV感染者的耐藥研究仍然較少，且近年來，隨著艾滋病相關(guān)領(lǐng)域研究的深入，中國疾病預(yù)防控制中心對國家免費(fèi)抗病毒治療方案進(jìn)行了修訂，吸毒人群的抗病毒治療情況有所改變。然而，目前仍缺乏HIV感染者耐藥的數(shù)據(jù)，需及時(shí)更新以指導(dǎo)該類人群的抗病毒治療。為進(jìn)一步了解吸毒人群的耐藥情況，減少耐藥毒株的產(chǎn)生與傳播，提高抗病毒的治療效果，本研究對使用阿片類毒品的HIV感染者進(jìn)行基因型耐藥分析，并探討耐藥的影響因素。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取于2016年4月至2017年12月分別在柳州市疾病預(yù)防控制中心、百色市田東縣及田陽縣疾病預(yù)防控制中心、南寧市紅十字會醫(yī)院招募使用阿片類毒品的230例HIV感染者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18周歲，具有1年以上的阿片類毒品使用史，HIV陽性，且成功擴(kuò)增HIVpol區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有重大慢性疾病、不愿簽署知情同意書者。本研究經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的審查批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集：采用自制問卷，以面對面方式收集研究對象的流行病學(xué)資料，包括年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化水平、最近一次CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、艾滋病相關(guān)知識知曉情況、吸毒史、抗病毒治療情況、是否有固定性伴侶、HIV陽性后是否與臨時(shí)性伴侶發(fā)生過性行為等，并同時(shí)查詢門診記錄。在問卷調(diào)查前，對工作人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.2.2.1 HIV DNA提?。翰杉芯繉ο笸庵莒o脈血5～10 mL，使用紅細(xì)胞裂解液(北京艾德萊公司，生產(chǎn)批號：282330AX)從外周靜脈血中分離出白細(xì)胞，將分離出的白細(xì)胞用細(xì)胞核裂解液(北京艾德萊公司，生產(chǎn)批號：292247AX)提取DNA。

1.2.2.2 目的基因的擴(kuò)增和測序：采用巢式-PCR方法，用Premix TaqTMPCR擴(kuò)增試劑盒(大連寶生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：AJ10460A)對HIVpol區(qū)的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并用G:BOX F3凝膠成像系統(tǒng)(英國 Syngene公司)對擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，將擴(kuò)增出的陽性樣本送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。

1.2.2.3 基因型耐藥分析：測序完成后，使用Sequencher 5.1軟件拼接序列。把拼接好的序列上傳至斯坦福大學(xué)的HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(http://hivdb.stanford.edu/hiv)進(jìn)行基因型耐藥分析。根據(jù)斯坦福耐藥系統(tǒng)檢測報(bào)告，獲得研究對象的耐藥突變位點(diǎn)、耐受的抗病毒藥物及各類藥物的耐藥評分。按Shafer等[12]建立的評分標(biāo)準(zhǔn)，將耐藥評分分為5個(gè)耐藥水平：0～9分為敏感、10～14分為潛在耐藥、15～29分為低度耐藥、30～59分為中度耐藥，≥60分為高度耐藥。低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥均視為耐藥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EpiData 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過雙錄入及一致性檢驗(yàn)后導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸模型(Enter 法)分析耐藥的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 使用阿片類毒品的HIV感染者耐藥發(fā)生率及其人口學(xué)特征 230例研究對象中，發(fā)生耐藥36例，耐藥發(fā)生率為15.7%(36/230)；共收集到189例研究對象最近一次CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余41例最近一次CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)不詳。230例研究對象年齡31～62(44.2±6.0)歲，以男性、漢族、未婚、初中及以下文化水平、知曉HIV知識、接受抗病毒治療、最近一次CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≥200個(gè)/μL、累計(jì)吸毒成癮時(shí)間≥10年、吸毒成癮期間日吸毒量<0.5 g/d、最近半年內(nèi)未吸毒、最近半年內(nèi)吸毒方式為注射吸毒、無固定性伴侶為主。與非耐藥組相比，耐藥組最近一次CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL的比例、無固定性伴侶的比例均升高(均P<0.05)。見表1。

表1 廣西阿片類毒品使用HIV感染者人口學(xué)特征(n=230)

2.2 使用阿片類毒品的HIV感染者抗病毒藥物的耐藥情況 在3種類型的HIV抗病毒藥物中，有27例僅對NNRTIs耐藥，2例僅對NRTIs耐藥，1例僅對PIs耐藥，4例同時(shí)對NNRTIs和NRTIs耐藥，2例同時(shí)對NNRTIs、NRTIs及PIs耐藥。NNRTIs耐藥發(fā)生率最高(14.3%，33/230)，其次是NRTIs(3.5%，8/230)，最低是PIs(1.3%，3/230)。見表2。在NNRTIs藥物中，發(fā)生耐藥的主要為NVP、RPV和EFV，其中NVP和RPV耐藥發(fā)生率均為8.7%，EFV耐藥發(fā)生率為8.3%；在NRTIs藥物中，發(fā)生耐藥的主要為ABC、FTC和3TC，其耐藥發(fā)生率均為2.6%；在PIs藥物中，ATV/r、DRV/r和LPV/r耐藥發(fā)生率均為0.4%。見表3。

表2 廣西使用阿片類毒品的HIV感染者不同類型的抗病毒藥物耐藥情況(n=230)

表3 廣西使用阿片類毒品的HIV感染者3種類型抗病毒藥物耐藥分析(n=230)

2.3 使用阿片類毒品的HIV感染者耐藥位點(diǎn)分析 對HIVpol區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增后共發(fā)現(xiàn)24個(gè)不同的耐藥突變位點(diǎn)，其中NNRTIs耐藥的相關(guān)位點(diǎn)突變頻率最高(17.4%，40/230)，其次是NRTIs(4.3%，10/230)，最低是PIs(1.3%，3/230)。NNRTIs相關(guān)的耐藥突變位點(diǎn)中，突變頻率最高為E138A(3.9%)，其次分別為K103N(3.0%)、V106A/I/M(2.6%)；NRTIs相關(guān)的耐藥突變位點(diǎn)中，M184V/I突變頻率最高，為2.6%；PIs相關(guān)的耐藥突變位點(diǎn)中，G73S突變頻率最高，為0.9%。見表4。

表4 廣西阿片類毒品使用HIV感染者耐藥突變位點(diǎn)分析(n=230)

2.4 使用阿片類毒品的HIV感染者耐藥影響因素分析 以是否耐藥為自變量，以2.1中的所有變量為自變量，納入多因素Logistic回歸模型中進(jìn)行分析，變量賦值情況見表5。結(jié)果顯示，最近一次CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≥200個(gè)/μL是耐藥發(fā)生的保護(hù)因素，無固定性伴侶是耐藥發(fā)生的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，而年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化水平、艾滋病相關(guān)知識知曉情況、是否抗病毒治療、累計(jì)吸毒成癮時(shí)長、成癮期間日吸毒量、最近半年內(nèi)是否吸毒、最近半年內(nèi)主要吸毒方式及HIV陽性后是否與臨時(shí)性伴侶發(fā)生性行為均與耐藥發(fā)生無關(guān)(均P>0.05)。見表6。

表5 變量賦值情況

表6 使用阿片類毒品的HIV感染者耐藥影響因素分析

3 討 論

本研究中，廣西阿片類毒品使用者以中老年、男性、漢族、未婚、初中及以下文化水平、最近半年內(nèi)吸毒方式為注射吸毒為主，與既往關(guān)于廣西吸毒人群的研究結(jié)果一致[13-14]；使用阿片類毒品的HIV感染者耐藥發(fā)生率為15.7%，與云南吸毒人群的耐藥發(fā)生率(15.3%)相近[10]，遠(yuǎn)高于廣州吸毒人群耐藥發(fā)生率(3.44%)[11]，也高于其他研究中男男性接觸者(4%～12%)[15-16]。根據(jù)耐藥警戒線的監(jiān)測方案，耐藥率在15%及以上為高流行水平[17]。因此，廣西使用阿片類毒品的HIV感染者耐藥率處于高度流行水平。不規(guī)范服藥是發(fā)生耐藥的危險(xiǎn)因素[18]，其不僅會使繼發(fā)耐藥風(fēng)險(xiǎn)增大，也增加了原發(fā)耐藥株的傳播風(fēng)險(xiǎn)，而吸毒人群抗病毒治療的依從性較差[19]，因此，加強(qiáng)廣西吸毒人群抗病毒治療的依從性，對減少耐藥毒株的發(fā)生和傳播具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，NNRTIs相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)以E138A和K103N突變?yōu)橹?，NRTIs相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)以M184V/I突變?yōu)橹?，與既往研究報(bào)道的以K103N、M184V/I突變?yōu)橹飨嗨芠20-23]；E138A突變頻率最高，與既往關(guān)于阿片類物質(zhì)使用者的耐藥結(jié)果一致[24]。Jeulin等[25]的研究顯示，E138A突變多出現(xiàn)在對RPV耐藥的患者中，與本研究中RPV耐藥發(fā)生率高的結(jié)果相符。K103N突變易引起不同程度的EFV和NVP耐藥，M184V/I突變可引起3TC和FTC耐藥[26-27]。因此，由主要突變引起的交叉耐藥應(yīng)當(dāng)引起重視。本研究中，使用阿片類毒品的HIV感染者以NNRTIs和NRTIs耐藥為主，與云南省有關(guān)抗病毒治療的HIV感染者的研究結(jié)果一致[18]，但與廣州注射吸毒人群以PIs和NNRTIs耐藥為主不同[11]，可能與各個(gè)研究的抗病毒治療方案和地區(qū)之間耐藥株的傳播不同有關(guān)。本研究中，NVP、EFV和3TC耐藥發(fā)生率較高，這與我國將EFV、NVP和3TC作為抗病毒治療的一線藥物有關(guān)。盡管抗病毒治療一線藥物的使用可以延緩疾病的進(jìn)展、提高患者的生活質(zhì)量，但大量使用也會導(dǎo)致部分藥物的耐藥率升高。本研究的36例耐藥者中，4例同時(shí)對NNRTIs和NRTIs耐藥，2例同時(shí)對NNRTIs、NRTIs及PIs耐藥，提示多重耐藥嚴(yán)重。因此，要密切檢測HIV的耐藥性，優(yōu)化使用阿片類毒品的HIV感染者抗病毒治療方案，以減少耐藥的發(fā)生。

本研究多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，耐藥的發(fā)生與使用阿片類毒品的HIV感染者的民族、年齡、性別、婚姻狀況、文化水平、抗病毒治療史、吸毒量及吸毒方式無關(guān)(P>0.05)，而最近一次CD4+T細(xì)胞數(shù)<200個(gè)/μL是該類人群耐藥發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，這與既往的研究結(jié)果一致[20,28]。CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)與機(jī)體免疫力有關(guān)，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)較低的機(jī)體對病毒的抑制能力較弱，其對抗病毒藥物耐藥的風(fēng)險(xiǎn)也隨之升高。同時(shí)，無固定性伴侶也是耐藥發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，這與吳欣華等[18]的研究結(jié)果一致。因此，需要密切監(jiān)測使用阿片類毒品的HIV感染者的治療情況，對免疫功能恢復(fù)效果較差的患者及時(shí)更改或優(yōu)化治療方案，同時(shí)加強(qiáng)對無固定性伴侶患者的隨訪管理，提高其治療依從性。

由于本研究局限于廣西部分地區(qū)，且樣本量較小，因此有關(guān)使用阿片類毒品的HIV感染者的耐藥位點(diǎn)及耐藥情況不能外推，今后需要納入更多地區(qū)、更大樣本量來進(jìn)一步探討。同時(shí)，本研究僅針對阿片類毒品的使用者，非阿片類毒品的吸毒人群及非吸毒人群與阿片類毒品使用者的耐藥情況是否有差異仍未可知。此外，本研究是橫斷面研究，有關(guān)耐藥的影響因素分析仍需進(jìn)行隊(duì)列研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，使用阿片類毒品的HIV感染者對抗病毒藥物的耐藥率處于高度流行水平，且以NNRTIs和NRTIs耐藥為主。密切監(jiān)測吸毒人群的HIV耐藥性，加強(qiáng)患者隨訪治療的管理，及時(shí)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抗病毒治療方案對減少HIV耐藥具有重要意義。