胡 康, 張伊動, 唐燕瓊, 李 宏, 馬 香, 劉 柱

(海南大學 生命科學與藥學院 熱帶生物資源教育部重點實驗室， ?？?570228)

AcrR蛋白是轉錄抑制因子TetR家族的成員，是一種負調(diào)控因子[1]。在大腸桿菌中已經(jīng)對AcrR蛋白開展了廣泛研究，其N末端形成典型的螺旋-轉角-螺旋結構，是其與DNA鏈的結合位點。被誘導時，AcrR會抑制acrAB的表達[2]。研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素-鎂復合物與AcrR結合能降低AcrR與DNA結合的親和力，并使多藥物外排復合物AcrAB轉錄活性增強[3]。AcrAB-TolC作為大腸桿菌中最主要的多藥外排泵，包括外膜通道蛋白TolC、周質(zhì)融合蛋白AcrA和藥物質(zhì)轉運子AcrB。最新研究表明，在植物乳桿菌中，轉錄調(diào)節(jié)因子AcrR可通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成提高乙醇耐受性，還可通過調(diào)控醛-醇脫氫酶(AdhE)控制植物乳桿菌對甘露醇和山梨醇的利用[4-5]。在假單胞菌中，AcrR可以調(diào)節(jié)鐵清除劑的合成，提高細菌在環(huán)境中的競爭力[6]。在流感嗜血桿菌中，AcrR與細菌在熱應激反應中對亞胺培南抗性增強相關[7]。另外AcrR突變會導致大腸桿菌對苯酚的抗藥性增強[8]。多藥物外排泵能外排有機溶劑、氧化劑及細菌產(chǎn)生的有害代謝物，并且能外排多種抗生素[9]。研究表明acrR基因的缺失會造成細菌致病性、運動性、耐藥性以及生物膜等表型變化，表明在細菌生長代謝中AcrR蛋白具有多重功能[10]。

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬弧菌科氣單胞菌屬，是革蘭氏陰性桿菌，其普遍存在于自然環(huán)境中[11]。作為一種新型水生動物病原菌，維氏氣單胞菌主要感染諸如錦鯉、草魚等經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，可導致其大量死亡[12]。這些年有關其感染人的病例也有逐年增多的趨勢，人食用了維氏氣單胞菌菌株污染的水產(chǎn)品、蔬菜時可引發(fā)腹瀉、敗血癥、心內(nèi)膜炎等[13]。本研究以AcrAB-TolC多藥外排泵為切入點，構建acrR基因敲除菌株，對其生長特性及生物膜成膜特性進行初步研究，試圖解析維氏氣單胞菌的致病機制及耐藥機理。研究結果對于防治重要水產(chǎn)病害、促進水產(chǎn)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及引物

自殺質(zhì)粒pRE112以及大腸桿菌WM3064菌株(Escherichiacoli,WM3064)、維氏氣單胞菌C4菌株(A.veronii, C4)均由本實驗室提供。本實驗用到的驗證及擴增引物序列信息如表1所示，由上海生物工程股份有限公司提供測序及引物合成。

表1 本實驗使用的引物序列

1.1.2 試劑盒、酶及藥品

細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；2×PCR Mix、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA/膠純化試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；T4連接酶、T4連接酶Buffer、BstX I、KpnI-HF和SacI-HF限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；氯霉素(Cam)、氨卞青霉素(Amp)、二氨基庚二酸(Dap)及瓊脂粉購自索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母提取物及氯化鈉均購自西隴科學股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1acrR基因上、下游同源序列擴增

用相應試劑盒提取維氏氣單胞菌C4的基因組DNA，隨后以其為模板，分別用acrR F1/R1和acrR F2/R2擴增目的片段。按照基因組DNA 1 μL，2×PCR Mix 13 μL，上或下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL的體系配制好溶液后，再進行如下PCR程序：95 ℃ 預變性 8 min；95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 60 s，25 cycles；72 ℃ 再延伸 10 min。

1.2.2 pRE112-ΔacrR載體構建

首先用質(zhì)粒提取試劑盒獲得自殺質(zhì)粒pRE112，在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育經(jīng)KpnⅠ-HF和ScaⅠ-HF內(nèi)切酶處理過的酶切產(chǎn)物30 min，隨后用純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育經(jīng)BstXⅠ內(nèi)切酶處理過的酶切產(chǎn)物30 min，再用純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。按以下連接體系(10 μL)：pRE112載體酶切產(chǎn)物(12 ng/μL) 5.0 μL、acrR上/下游同源臂酶切產(chǎn)物(60 ng/μL)各1 μL，10×T4 Buffer 1 μL，T4連接酶1 μL，ddH2O 1 μL，將質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與片段酶切產(chǎn)物在22 ℃下體外連接2 h。吸取1 μL上述連接產(chǎn)物電轉化到E.coliWM3064感受態(tài)細胞中，在37 ℃下于含有Dap和Cam的抗性平板中培養(yǎng)，隔天挑菌驗證陽性克隆。

1.2.3 雙親接合及acrR基因敲除菌株的篩選

將維氏氣單胞菌C4于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，并將攜帶有pRE112-ΔacrR質(zhì)粒的大腸桿菌WM3064于含Dap和Cam的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌分別轉接培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，將維氏氣單胞菌C4和大腸桿菌WM3064按1∶1、1∶3和1∶7的比例混合至終體積為800 μL。6 000 r/min離心3 min 后除去大部分上清液，將剩余菌液混勻后滴于含有DAP的LB平板上，30 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h后，在平板上滴加1 mL液體LB培養(yǎng)基并用涂布棒將長出的菌落刮下，取100 mL菌液涂布于含有Cam和Amp的雙抗平板上，待菌落長出后PCR驗證接合結果。將接合成功的維氏氣單胞菌C4于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取100 μL涂布于含有22%蔗糖和Amp的LB固體培養(yǎng)基上30 ℃倒置培養(yǎng)16 h。菌落PCR驗證敲除菌株。

1.2.4 生長曲線測定

挑取野生型維氏氣單胞菌C4和ΔacrR菌株的單菌落，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中30 ℃，150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，次日轉接菌液于含Amp的新鮮LB培養(yǎng)基中至終濃度OD600為0.02，每間隔1 h取樣，分別測定培養(yǎng)菌的OD600數(shù)值，然后繪制野生型維氏氣單胞菌C4和ΔacrR菌株的生長曲線。

1.2.5 生物膜測定

在24孔聚苯乙烯培養(yǎng)板中每孔添加1 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基，按OD600為0.01分別接種過夜培養(yǎng)的野生型維氏氣單胞菌C4及ΔacrR的菌液，30 ℃靜置孵育24 h；將培養(yǎng)液吸出，每孔加入1 mL無菌PBS緩沖液沖洗；再向每孔中加入1 mL甲醇處理20 min，隨后將培養(yǎng)孔中殘余的甲醇吸出；向每孔中加入1 mL 0.5%結晶紫溶液，染色10 min；吸出培養(yǎng)孔中的結晶紫染色液后，用流水把殘余的染料沖凈；隨后將培養(yǎng)板倒置在濾紙上以便除去殘余的水分，并于37 ℃烘箱中徹底烘干水分；再向每孔加入1 mL 33%醋酸溶液，在37 ℃下反應30 min以溶解結晶紫；用酶標儀測定培養(yǎng)孔中溶液的OD570值。

2 結果與分析

2.1 pRE112-ΔacrR載體的構建

以野生型維氏氣單胞菌C4(WT)基因組DNA為模板，PCR擴增得到acrR上、下游同源臂片段。凝膠電泳結果顯示，acrR上游同源臂和下游同源臂的PCR產(chǎn)物均在300 bp左右，而且PCR產(chǎn)物條帶單一、明亮(圖1)。acrR上游同源臂長度為304 bp，acrR下游同源臂片段長度為311 bp，表明目的產(chǎn)物擴增成功。

M: DL5000 DNA Marker; 1: acrR上游同源臂; 2: acrR下游同源臂

將提取的pRE112質(zhì)粒以及PCR擴增得到的acrR上、下游同源臂片段分別進行酶切，然后用T4連接酶22 ℃孵育2 h，通過電轉將連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌WM3064感受態(tài)細胞，并涂布于氯霉素抗性板中用于篩選，次日隨機挑選單菌落，然后使用載體驗證引物pRE112F/R進行菌落PCR擴增驗證，并用空載體pRE112為模板作為陽性對照，以篩選陽性克隆。結果顯示，空載體pRE112的PCR產(chǎn)物長度約為500 bp, 驗證片段大小約為1 100 bp (圖2)，說明pRE112-ΔacrR載體構建成功。

M: DL5000 DNA Marker; 1～6: pRE112-ΔacrR基因敲除質(zhì)粒菌落PCR產(chǎn)物; 7: 陽性對照; 8: 陰性對照

2.2 雙親接合及ΔacrR菌株的篩選

將上述轉入大腸桿菌WM3064中的重組載體pRE112-ΔacrR通過雙親接合實驗轉入到野生型維氏氣單胞菌中，在含Cam和Amp的雙抗平板上篩選陽性菌株，并用載體驗證引物pRE112F/R進行菌落PCR擴增驗證。結果顯示，擴增條帶大約為1 100 bp，pRE112-ΔacrR載體質(zhì)粒已經(jīng)成功接合至維氏氣單胞菌中(圖 3)。然后利用22%蔗糖壓力篩選以獲得陽性突變菌株。使用acrR-F0/R0引物進行菌落PCR，選取野生型維氏氣單胞菌C4基因組PCR產(chǎn)物為陽性對照。結果顯示，突變株菌落PCR擴增條帶明顯低于野生型維氏氣單胞菌C4的擴增條帶。挑取3個陽性突變株進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物并送測序，測序結果顯示ΔacrR菌株構建成功(圖 4)。

M: DL5000 DNA Marker; 1～6: PCR驗證產(chǎn)物; 7: 陽性對照; 8: 陰性對照

2.3 ΔacrR敲除對生長的影響

為了探究acrR基因的敲除是否會影響維氏氣單胞菌的生長，分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型維氏氣單胞菌C4和ΔacrR菌株，并每隔1 h對OD600值進行測定。結果顯示ΔacrR菌株同野生型菌株生長速率一致，即acrR基因的敲除不會影響維氏氣單胞菌的生長(圖5)。

M: DL5000 DNA Marker; 1～6: 敲除株驗證PCR產(chǎn)物; 7: 陽性對照; 8: 陰性對照

圖5 野生型維氏氣單胞菌C4及acrR敲除株生長曲線測定

2.4 ΔacrR敲除對生物膜形成的影響

為了探究acrR基因敲除對維氏氣單胞菌生物膜形成的影響，將在24孔板中培養(yǎng)24 h后的野生型維氏氣單胞菌C4及ΔacrR菌株的培養(yǎng)液吸出，經(jīng)PBS洗滌、甲醇固定、0.5%結晶紫染色、PBS洗滌及33%醋酸染色后，用酶標儀測定培養(yǎng)孔中溶液的OD570值。結果顯示ΔacrR菌株測出的OD570值顯著高于野生型菌株，即敲除acrR基因后，細菌形成生物膜的能力顯著增強(圖 6)。

圖6 野生型維氏氣單胞菌C4及acrR敲除株生物膜形成測定

3 結論

本研究鑒定了AcrR蛋白對于維氏氣單胞菌生長和成膜能力的影響。通過對野生型菌株及ΔacrR菌株的生長特性分析發(fā)現(xiàn),AcrR蛋白的缺失并不影響維氏氣單胞菌的生長，維氏氣單胞菌株中敲除acrR基因導致菌株形成生物膜的能力顯著增加，這一結果與醫(yī)院不動桿菌acrR基因敲除株的表型一致,暗示AcrR蛋白通過調(diào)控AcrAB外排泵而參與生物膜的形成[10]。本研究結果為抵抗生物膜形成相關的病原菌提供了新的研究思路和作用靶標。