郝惠文， 陶 冶， 宋慧茹， 楊 波,2， 王 毅,2， 胡 征,2

(1. 湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院， 武漢 430068； 2. 湖北工業(yè)大學 發(fā)酵工程教育部重點實驗室， 武漢 430068)

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)革蘭氏陰性菌[1]是兒童和成人侵襲性肺部感染的主要病因之一[2]。已知的流感嗜血桿菌定植部位是人類上呼吸道和下呼吸道[3]，莢膜菌株中b型流感嗜血桿菌[4](Haemophilusinfluenzaetype b， Hib)和無莢膜型流感嗜血桿菌(Non-typeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)[4]能引起腦膜炎、膿毒癥、急性中耳炎、肺炎和結膜炎等疾病[5]。這顯示了Hib和NTHi菌株在臨床診斷的緊迫性與重要性[6]。 目前臨床診斷流感嗜血桿菌感染的方法主要有“金標準”培養(yǎng)法[7]、血清學檢測[8]和核酸檢測[9]。這些方法存在檢測時間過長、操作步驟復雜、成本較高等局限性。膠體金免疫層析法具有簡便、快速、準確度高等優(yōu)點，更適用于床旁檢測。單克隆抗體的均一、穩(wěn)定、高特異性等優(yōu)點使免疫層析技術在病原診斷領域得到廣泛應用。

流感嗜血桿菌的外膜蛋白P6是一種肽聚糖相關的脂蛋白，在不同莢膜血清型以及無莢膜菌株間表現(xiàn)出高度保守性和抗原性，被認為是檢測流感嗜血桿菌的理想目標[10]。因此，本研究擬用單克隆抗體建立基于雙抗體夾心免疫層析技術的流感嗜血桿菌快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料與菌株

重組蛋白P6-His，由本實驗室構建并表達純化[11]。8周齡的BALB/c雌性小鼠購自湖北省疾病預防控制中心。菌種：流感嗜血桿菌(H.influenzae，ATCC 49247)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae，ATCC 25238)、卡他莫拉菌(M.catarrhalis，ATCC 49619)、肺炎支原體(M.pneumonia，ATCC 15531)和嗜肺軍團菌(L.pneumophila，ATCC 33152)均購自ATCC；金黃色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、產酸克雷伯菌(K.oxytoca)、鮑曼不動桿菌(A.baumannii)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)均由湖北省武警總醫(yī)院分離鑒定。

1.2 主要設備和試劑

Protein A親和層析柱購自常州天地人和生物科技；Sephadex G25 凝膠填料購自 GE；羊抗鼠IgG購自武漢飛羿科技；亞型鑒定試劑盒購自Proteintech；Octet Red 96e分子相互作用儀購自ForteBio；硝酸纖維素膜(CN140)購自Sartorius；玻璃纖維膜(CB08)、吸水紙(CH37K)、PVC板(SM31-40)購自上海良信科技。

1.3 方法

1.3.1 單克隆抗體的制備和純化

按常規(guī)方法用P6重組蛋白免疫BALB/c小鼠3次，取SP2/0與免疫小鼠脾細胞按1∶5比例混合進行細胞融合。分別以P6重組蛋白和滅活的Hi菌為包被抗原，經ELISA篩選及多次亞克隆，得到穩(wěn)定目標抗體的雜交瘤細胞株。將篩選到的陽性雜交瘤細胞注射至已提前佐劑致敏的BALB/c小鼠腹腔，10～12 d后收集腹水，用Protein A 親和層析純化腹水，純化后的抗體用紫外分光光度儀檢測濃度，SDS-PAGE分析其純度。

1.3.2 單克隆抗體的鑒定

2)Western Blot特異性鑒定。將離心收集Hi菌超聲破碎，離心后分別收集超破后的菌體上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，以P6重組蛋白為陽性對照，轉至PVDF膜，將制備的單抗分別作為一抗孵育，以HRP標記的羊抗鼠為二抗，通過ECL化學發(fā)光進行顯影。

3)相互作用力檢測。采用無標記分子相互作用儀對純化后的單克隆抗體進行抗原抗體相互作用力檢測。將鼠免疫球蛋白定量傳感器(AMC)經緩沖液平衡后在純化后的單克隆抗體中固化；洗去非特異性結合的雜質后再浸入含Hi菌緩沖液中進行結合；經平衡后在解離緩沖溶液中解離，利用儀器的分析軟件得到動力學常數(shù)。用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行整理生成結合解離曲線。

1.3.3 膠體金免疫層析試紙條的制備

用檸檬酸還原法制備40 nm膠體金[11]，并將抗體分別進行膠體金的標記及劃線，進行組裝、斬切形成0.4 cm的試紙條，加入干燥劑密封保存。

1.3.4 免疫層析試紙性能評估

1)特異性測試。用試紙條分別檢測108CFU/mL滅活的Hi菌和其他9種呼吸道常見病原菌，鑒定試紙條的特異性。

2)靈敏性測試。用試紙條分別檢測將從1.0×109至1.0×106CFU/mL不同濃度的Hi菌，以能觀察到陽性結果的最低菌濃度作為試紙條的檢測極限。

3)穩(wěn)定性和重復性測試。將制備的3個批次的試紙條放置45 ℃儲存，分別在間隔10、25和37 d時，用適當濃度的陽性樣本和陰性樣本檢測試紙條的穩(wěn)定性，根據(jù)公式推導其常溫下的保存時間。

2 結果與分析

2.1 陽性雜交瘤細胞株的篩選

對融合后的細胞經培養(yǎng)7～9 d后，取其上清液通過間接ELISA測定，選取陽性數(shù)值較高的細胞株，經3次亞克隆最終得到2株穩(wěn)定的分泌目的抗體的單克隆抗體細胞株，分別命名為Hi-1#和Hi-2#。

2.2 抗體的亞型及濃度測定

取兩種純化后的單克隆抗體，經鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對制備的單抗亞類進行鑒定，其重鏈均為IgG1型，輕鏈均為Kappa型。用紫外分光光度儀測定兩種抗體總量，分別為2.1和3.2 mg，經SDS-PAGE驗證純度在95%以上(圖1)。

M：蛋白質分子量標準；1：Hi-1#；2：Hi-2#

2.3 單克隆抗體效價測定

表1 純化后單克隆抗體效價測定ELISA結果

2.4 抗體的特異性鑒定

通過Western Blot鑒定兩種抗P6蛋白單克隆抗體是否能與流感嗜血桿菌特異性結合(圖2)。泳道1、4中均出現(xiàn)條帶，且條帶位置與表達純化的P6-His蛋白大小一致，泳道2、3、5和6出現(xiàn)條帶位置與文獻報道的天然P6蛋白大小一致(約16 ku)。結果表明兩種單克隆抗體均能夠高特異性識別流感嗜血桿菌的天然P6蛋白。

2.5 抗體的親和力鑒定

由圖3和表2可知：兩種單抗分別與流感嗜血桿菌相互作用力KD值分別為10-9和10-10，有較強的親和力；解離速率常數(shù)(kdis)解離速率均在10-3～10-4，說明抗原抗體結合得很穩(wěn)定；R2>0.9，說明擬合曲線與實際曲線擬合度高。由此可得兩種抗體與Hi菌均有較好的親和力。

M：彩色預染蛋白；1、4：P6-His蛋白；2、5：流感嗜血桿菌超破上清；3、6：流感嗜血桿菌超破沉淀。(a)Hi-1#；(b)Hi-2#

(a)Hi-1#；(b)Hi-2#

表2 生物膜干涉技術(BLI)檢測數(shù)據(jù)結果

2.6 膠體金試紙?zhí)禺愋詼y試

制備的流感嗜血桿菌的試紙條，與Hi菌反應為陽性，與其他9種呼吸道常見病原菌的檢測結果均為陰性，結果見圖4。這表明制備的流感嗜血桿菌檢測試紙條具有高的特異性。

圖4 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測

2.7 膠體金試紙靈敏度測試

在Hi菌的連續(xù)稀釋液中，試紙條的檢出限為1×107CFU/mL，結果見圖5。

圖5 流感嗜血桿菌膠體金免疫層析試紙條的檢測靈敏度

2.8 膠體金試紙穩(wěn)定性測試

隨著存放時間的延長，檢測線和質控線的顏色無明顯變化，當45 ℃存放時間達到37 d時，檢測線和質控線均正常(圖6)，因此檢測卡可在45 ℃儲存37 d，根據(jù)經驗公式，相當于在常溫儲存1年。

(a)45 ℃保存10 d；(b)45 ℃保存25 d；(c)45 ℃保存37 d

3 討論與結論

研究表明無莢膜的NTHi菌株感染率逐年上升[13]，但缺乏較為簡便、快速、穩(wěn)定的檢測方法。陶冶等[11]針對P6線性抗原表位設計得到多克隆抗體膠體金免疫層析試紙，有較高的靈敏度但是多抗特異性弱且不穩(wěn)定。Zhao等[14]研究表明P6蛋白在所有H.influenzae間均有表達，其具有種屬特異性、廣譜表達性，該蛋白暴露在胞外，且具有較好的免疫原性。本研究確定以P6蛋白作為H.influenzae的檢測標志物，采用單克隆抗體與膠體金試紙相結合，其優(yōu)點在于單克隆抗體穩(wěn)定性高且均一及特異性強，并且適合大規(guī)模生產。