張晉雷，薄延橋

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischenic encephalopathy，HIE)是由于新生兒在圍生期窒息缺氧，導(dǎo)致腦部缺氧造成的一系列腦損傷[1]，是新生兒腦病中最常見(jiàn)的疾病之一。HIE患兒大部分都有宮內(nèi)窘迫史，病情嚴(yán)重時(shí)可造成新生兒早期死亡、不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷和不同程度后遺癥等，是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的常見(jiàn)病因[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不參與轉(zhuǎn)錄翻譯，適合作為疾病早期診斷的追蹤觀測(cè)對(duì)象[3]。謝時(shí)帥等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與中樞神經(jīng)的發(fā)育有關(guān)，并在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。已有研究表明，miR-424在血管性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[5]，但是對(duì)于這兩種微小RNA是否與HIE有關(guān)以及其在HIE中表達(dá)趨勢(shì)的相關(guān)研究較少。因此，本研究從檢測(cè)miR-15b、miR-424在HIE患兒血清中表達(dá)水平入手，探究其與HIE發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年4月—2017年4月我院兒科收治的68例HIE患兒為試驗(yàn)組，其中男35例，女33例；胎齡36～42(39.87±1.96)周；體重2.71～4.02(3.69±0.41)kg。根據(jù)患兒臨床HIE分度標(biāo)準(zhǔn)[6-7]分為輕度組、中度組和重度組，其中輕度組24例，中度組28例，重度組16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HIE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，確診為新生兒缺氧缺血性腦病；②無(wú)宮內(nèi)感染及先天遺傳性疾病；③臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天發(fā)育畸形；②孕婦妊娠期間有各種急慢性感染及宮內(nèi)感染史，嚴(yán)重肝、腎功能不全，惡性腫瘤，自身免疫性疾病，惡性心律失常，產(chǎn)后7 d內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)后并發(fā)癥；③產(chǎn)傷性顱內(nèi)出血。同時(shí)選取我院68名同期分娩的健康嬰兒為對(duì)照組，其中男37名，女31名；胎齡38～41(40.15±0.89)周；體重2.89～3.87(3.61±0.32)kg。兩組性別、胎齡、出生體重等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。詳見(jiàn)表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有樣品采集均取得受試新生兒家長(zhǎng)知情同意并簽字，符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)《赫爾辛基宣言》。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司，批號(hào)：DP443)；miScript SYBR?Green Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)Q221-01)；引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成；qRT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，型號(hào)CFX96)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及保存 入選新生兒均于出生后48 h內(nèi)抽取股靜脈血3 mL置于紅色采血管中，3 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min后，取上清液分裝于EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)miR-15b、miR-424表達(dá)水平 采用qRT-PCR檢測(cè)HIE患兒和健康新生兒血清中miR-15b、miR-424水平。采用RNA提取試劑盒提取HIE患兒血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用定量PCR儀對(duì)miR-15b和miRNA-424進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，雙蒸水(dd H2O)3.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃、90 s，95 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法對(duì)miR-15b、miR-424表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。引物序列見(jiàn)表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3.3 新生兒神經(jīng)行為測(cè)量(Neonatal Behavioral Neurological Assessment，NBNA)評(píng)分測(cè)定 試驗(yàn)組HIE患兒在出生后28 d測(cè)定NBNA評(píng)分[8]。NBNA評(píng)分包括6項(xiàng)行為能力評(píng)分、4項(xiàng)被動(dòng)肌張力評(píng)分、4項(xiàng)主動(dòng)肌張力評(píng)分、3項(xiàng)原始反射評(píng)分及3項(xiàng)一般狀態(tài)評(píng)分。每項(xiàng)評(píng)分分值為0～2分，總分40分，>37分表示神經(jīng)功能正常，35～37分為臨界異常，<35分為異常。

1.4 隨訪 所有HIE患兒均接受門(mén)診復(fù)診或電話隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，隨訪2年，截止時(shí)間為2019年5月1日。隨訪期間無(wú)患兒失訪。隨訪期間測(cè)定并記錄患兒NBNA評(píng)分、腦性癱瘓和癲癇發(fā)病情況、生存情況。根據(jù)隨訪情況分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。預(yù)后不良為患兒發(fā)生下列其中1項(xiàng)：NBNA評(píng)分<35分、腦性癱瘓、癲癇或死亡[9-10]。

2 結(jié) 果

2.1 HIE患兒和健康新生兒血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平比較 HIE患兒血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平均明顯低于健康新生兒(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 HIE患兒和健康新生兒血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平比較(±s)

2.2 不同嚴(yán)重程度HIE患兒血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平比較 與輕度組比較，重度組、中度組HIE患兒出生后28 d血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與中度組比較，重度組HIE患兒出生后28 d血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 不同嚴(yán)重程度HIE患兒血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平比較(±s)

2.3 不同病情嚴(yán)重程度HIE患兒出生后28 d NBNA評(píng)分比較 重度組、中度組出生后28 d NBNA評(píng)分低于輕度組(P<0.05)。重度組出生后28 d NBNA評(píng)分低于中度組(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 不同病情嚴(yán)重程度HIE患兒出生后28 d NBNA評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.4 miR-15b、miR-424表達(dá)水平與出生后28 d NBNA評(píng)分的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，HIE患兒miR-15b、miR-424表達(dá)水平與出生后28 d NBNA評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.256，P<0.05；r=0.317，P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 miR-15b、miR-424表達(dá)水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性分析

2.5 血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平與HIE患兒預(yù)后關(guān)系 預(yù)后良好組HIE患兒血清miR-15b、miR-424高表達(dá)率均明顯高于預(yù)后不良組患兒(P<0.05)。詳見(jiàn)表7。

表7 血清miR-15b、miR-424表達(dá)水平與HIE患兒預(yù)后關(guān)系 單位：例(%)

3 討 論

HIE在新生兒中多見(jiàn)，發(fā)病率為活產(chǎn)足月兒的0.3%～0.6%[11]。根據(jù)HIE臨床分度可將HIE患兒分為輕度、中度、重度。HIE會(huì)導(dǎo)致不同程度的后遺癥，與患兒后遺癥嚴(yán)重程度、預(yù)后有關(guān)的因素有許多，如臨床分度、NBNA評(píng)分、介入治療時(shí)間等。造成HIE的原因很多[12]，如圍產(chǎn)期宮內(nèi)窘迫、難產(chǎn)等。在分娩過(guò)程中發(fā)生窒息經(jīng)過(guò)搶救，并及時(shí)采取相應(yīng)治療措施后，可控制HIE的發(fā)生，但是對(duì)于嚴(yán)重窒息的嬰兒，HIE發(fā)病率依然很高，窒息缺氧直接導(dǎo)致嬰兒腦部供血不足，此時(shí)腦部區(qū)域糖酵解作用大幅度增加[13]，腦細(xì)胞氧化代謝受損；同時(shí)，腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能減退，血管周?chē)募?xì)胞病變導(dǎo)致管腔變窄甚至閉塞，腦部形成不可逆性損傷，導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，探究HIE的發(fā)病機(jī)制，尋找有效應(yīng)對(duì)措施和治療方法是目前的研究熱點(diǎn)。

miR-15b是miR-15/16家族成員一員[14]，在機(jī)體各系統(tǒng)、特別是血管內(nèi)皮系統(tǒng)廣泛表達(dá)，主要影響細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、成管能力等。已有研究表明，在動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)中，miR-15b與血管形成、細(xì)胞凋亡等調(diào)節(jié)有關(guān)[15-16]。黃姿等[17]研究發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定型心絞痛、急性ST段抬高型心肌梗死病人血漿中miR-15b表達(dá)水平降低，說(shuō)明miR-15b與急性冠脈綜合征病人冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度有關(guān)。Zhu等[14]研究表明miR-15b有抗血管生成的作用。本研究發(fā)現(xiàn)HIE患兒血清miR-15b表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，說(shuō)明miR-15b可能與HIE發(fā)生有關(guān)。麥友剛等[18]在肺成纖維細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，miR-15b過(guò)表達(dá)可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)水平，參與支氣管發(fā)育不良過(guò)程。王薇等[19]研究表明，VEGF參與HIE病理生理過(guò)程，VEGF可聯(lián)合突變型低氧誘導(dǎo)因子促進(jìn)血管新生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒血清miR-15b表達(dá)水平與HIE患兒28 d NBNA分值呈正相關(guān)，提示miR-15b可能反映HIE患兒病程的發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組HIE患兒血清miR-15b高表達(dá)率均明顯高于預(yù)后不良組患兒，提示miR-15b低表達(dá)可能與HIE患兒的不良預(yù)后有關(guān)。

Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-424可調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)，減輕小鼠缺血性腎損傷，對(duì)缺血性再灌注損傷有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-424在HIE患兒血清中表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降，說(shuō)明miR-424可能與HIE的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-424的表達(dá)與HIE患兒分度有關(guān)，提示miR-424可能參與HIE病情的發(fā)生發(fā)展。郜樂(lè)樂(lè)等[5]在急性腦梗死研究中發(fā)現(xiàn)，miR-424在急性腦梗死病人中表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)水平與急性腦梗死患病程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-424的表達(dá)水平隨HIE病情嚴(yán)重程度上升而下降，且與HIE患兒出生后28 d NBNA評(píng)分呈正相關(guān)，說(shuō)明miR-424可能參與HIE病程的發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組HIE患兒血清miR-424高表達(dá)率明顯降低，提示miR-424可能與HIE患兒預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，HIE患兒血清中miR-15b、miR-424表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，與臨床分度、出生后28 d NBNA評(píng)分有關(guān)，對(duì)預(yù)后有影響，可能在HIE的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用。本研究不足之處為統(tǒng)計(jì)樣本量不足，后期將增加樣本量對(duì)miR-15b、miR-424在HIE疾病進(jìn)展中的作用進(jìn)行深入研究。