邱伯雍，魏易洪，曹 敏，毛美嬌，吳 瓊，周 端，湯 諾，唐靖一

人參皂苷是人參的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等廣泛而復(fù)雜的藥理作用[1]。諸多研究表明人參皂苷對心臟相關(guān)疾病有明顯改善作用[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，作為皂苷類成分之一的人參皂苷Rb3亦可通過激活抗氧化信號通路[4]、改善心肌缺血[5-6]、抑制細胞凋亡[7]等途徑保護心肌細胞。在心血管疾病中，活性氧的產(chǎn)生對心肌和血管具有重要作用[8]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧可引起心肌細胞凋亡，心臟功能障礙，導(dǎo)致心功能下降[9]。過氧化氫(H2O2)作為氧化應(yīng)激的外源性誘導(dǎo)因子，是研究諸多藥物抗心肌氧化損傷、凋亡等的常用模型[10-12]。但人參皂苷Rb3在氧化損傷過程中對心肌細胞的作用及機制的研究報道不多。故本研究擬采用H2O2誘導(dǎo)心肌細胞H9c2建立氧化損傷模型，檢測人參皂苷Rb3對該模型中缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA表達作用，同時使用磷酯酰激醇3-激酶(PI3K)抑制劑LY294002(LY294)，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 大鼠心肌細胞株H9c2細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 人參皂苷Rb3購自成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST14072211；30%H2O2、氯仿、異丙醇、乙醇均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PI3K抑制劑LY294購自碧云天生物工程有限公司；Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司；ROX購自Roche公司；焦碳酸乙二酯購自Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自HyClone公司。

1.3 儀器 Applied Biosystems 7900HT熒光定量PCR儀購自Funglyn Biotech公司；低溫高速離心機、移液器、微型離心機購自Eppendorf公司；-20 ℃冰箱購自青島海爾股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 H9c2細胞培養(yǎng) H9c2心肌細胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞長到約80%融合時使用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代，平均約3 d傳一代。

1.4.2 溶液制備 將人參皂苷Rb3溶解在二甲基亞砜(DMSO)中配制成100 mmol/L儲備液，儲存于-20 ℃冰箱，臨用時以培養(yǎng)液稀釋制成25 μmol/L的藥液。取30% H2O2溶液適量，以培養(yǎng)液稀釋制成400 μmol/L的溶液，即用即配。

1.4.3 給藥及分組 將對數(shù)生長期的H9c2細胞接種于6個5 cm培養(yǎng)皿內(nèi)(2.0×105個/mL)，在10% DMEM培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為0.5%DMEM培養(yǎng)液，設(shè)立空白對照組、Rb3組、Rb3+LY294組、H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組。在人參皂苷 Rb3處理前30 min加入30 μmol/L LY294，25 μmol/L Rb3預(yù)處理24 h后，加入400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡1 h、2 h后，各組進行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(real time PCR，RT-PCT)檢測。

1.5 RT-PCR反應(yīng) 采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄法，用Trizol試劑提取細胞總RNA來合成cDNA；cDNA可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增。以Actin為內(nèi)參基因，分別對HIF-1α、VEGF進行擴增。RT-PCR反應(yīng)體積為20 μL，利用2-ΔΔCT計算mRNA相對表達量。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 H2O2作用1 h時人參皂苷Rb3對H9c2中HIF-1α、VEGF表達的影響 HIF-1α的mRNA表達情況：與空白對照組比較，H2O2+Rb3組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，H2O2+Rb3+LY294組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。H2O2+Rb3組與H2O2+Rb3+LY294組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖1A。

VEGF的mRNA表達情況：與空白對照組比較，H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組

VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)。H2O2+Rb3組與H2O2+Rb3+LY294組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖1B。

表2 H2O2作用1 h各組HIF-1α、VEGF的mRNA表達水平比較(±s)

與空白對照組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，#P<0.01。

2.2 H2O2作用2 h時人參皂苷Rb3對H9c2中HIF-1α、VEGF表達的影響 HIF-1α的mRNA表達情況：與空白對照組比較，H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組HIF-1α mRNA明顯升高(P<0.01)，H2O2+Rb3+LY294組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與H2O2+Rb3組比較，H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α mRNA降低(P<0.01)。詳見表3、圖2A。

VEGF的mRNA表達情況：與空白對照組比較，H2O2組、H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)，其余組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Rb3組、H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA明顯升高(P<0.01)。H2O2+Rb3組與H2O2+Rb3+LY294組VEGF mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3、圖2B。

表3 H2O2作用2 h各組HIF-1α、VEGF的mRNA表達水平比較(±s)

與空白對照組比較，＊P<0.01；與H2O2組比較，#P<0.01；與H2O2+Rb3組比較，△P<0.01。

3 討 論

HIF-1α在低氧狀態(tài)下被激活表達，在缺氧誘導(dǎo)的基因表達中起著關(guān)鍵作用，是心肌細胞對急性缺血和心肌梗死的早期低氧環(huán)境的適應(yīng)性表達[13]，其靶基因VEGF是參與血管生成的重要信號蛋白，具有改善血管內(nèi)皮細胞功能，促進血管再生的功效[14]。研究表明，HIF-1α能夠改善大鼠急性心肌缺血，縮小轉(zhuǎn)基因小鼠心肌梗死面積，增加梗死區(qū)域及其周圍毛細血管密度，改善心功能[15-16]。VEGF是心肌梗死后的血管生成反應(yīng)的觸發(fā)因子[17]，其亞型VEGF165能夠通過激活PI3K和Bcl-2通路抗心肌凋亡，縮小心肌梗死面積[18]。在成年小鼠主動脈瓣狹窄模型研究中，VEGF可以增加毛細血管密度，保護線粒體功能，減少心肌細胞凋亡，促進心肌細胞增殖，最終保護心功能[19]。

HIF-1α和VEGF共同參與心肌細胞氧化應(yīng)激過程，如吳昊昱等[20]在H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)大鼠真皮成纖維細胞在H2O2實驗組(20 μmol/L)中VEGF的表達量較正常組輕微提高。沈湘波等[21]發(fā)現(xiàn)，H2O2在低濃度(50 μmol/L)時即可顯著升高支氣管上皮細胞中VEGF的表達，且具有PI3K通道依賴性。蘇其利等[22]研究H2O2誘導(dǎo)H9c2大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激的實驗表明，花旗松素可以激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶1(HO-1)/HIF-1α/Autophagy信號通路，促進心肌細胞抗氧化應(yīng)激。本實驗中，與空白對照組比較，H2O2組中HIF-1α和VEGF的表達均增加(P<0.01)。表明人參皂苷Rb3能夠上調(diào)HIF-1α及VEGF的表達，人參皂苷Rb3可能具有保護心肌細胞氧化應(yīng)激所致?lián)p傷和凋亡的作用。

LY294是PI3K抑制劑，能抑制蛋白激酶B(Akt)磷酸化。本實驗中，H2O2作用1 h時，H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α的表達量低于H2O2+Rb3組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)H2O2作用2 h時，H2O2+Rb3+LY294組HIF-1α的表達明顯低于H2O2+Rb3組(P<0.01)，表明人參皂苷Rb3上調(diào)HIF-1α可能是通過PI3K/Akt通路。然而，LY294不能阻斷VEGF的mRNA高表達，說明人參皂苷Rb3可能是通過其他信號通路調(diào)節(jié)H2O2模型的VEGF。

心肌細胞再生能力微弱，各種刺激都會誘發(fā)不可逆的心肌損傷，故而需要尋求更佳的藥物來防治心血管疾病。中藥人參擁有補五臟之元、復(fù)脈安神、益智延年之功效，在心血管疾病中運用廣泛。本研究對人參皂苷Rb3干預(yù)H2O2損傷心肌細胞的作用及機制進行了初步探討，為中醫(yī)藥防治心血管疾病提供了更多的科學(xué)依據(jù)和思路。