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銀杏葉片對缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞的保護作用研究

2020-12-20 03:47:08
浙江中醫(yī)雜志 2020年12期
關(guān)鍵詞:復(fù)氧消耗量銀杏葉

杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重,甚至發(fā)生不可逆行損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷,亦稱為心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷,主要由能量代謝、氧化應(yīng)激、鈣離子超載等因素所致。自20世紀(jì)60年代,德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)銀杏葉中含有治療心腦血管疾病的藥效成分以來,越來越多的研究表明,銀杏葉提取物在心腦血管疾病的治療中具有很好的藥理活性[1-2]。銀杏葉片是臨床常用的心腦血管保護制劑,具有活血化瘀通絡(luò)之功效,本文在細胞水平研究其對缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞的保護作用,以評估其在臨床心血管急癥中的治療價值。

1 材料與方法

1.1 材料:Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒(聯(lián)科生物),PBS緩沖液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。流式細胞儀(BD,F(xiàn)ACSCanto);酶標(biāo)儀(賽默飛,Multiskan FC)。心肌細胞(H9C2細胞)購自中國科學(xué)院上海細胞庫,用含有10%熱滅活FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基置37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗方法:分述如下。

1.2.1 細胞存活率和線粒體氧呼吸率實驗:H9C2細胞接種于96孔板,10%FBS高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(Gibco)24hrs后,加入含有大銀杏葉片(稀釋1/50,1/100,1/200)無糖無血清培養(yǎng)液(Gibco),放入缺氧小室和缺氧箱(95%N2/5%CO2)培養(yǎng)22h后全培養(yǎng)基復(fù)氧2h,同時設(shè)正常對照和模型組。采用MTT法測定細胞存活率;采用液相氧呼吸儀測定細胞氧呼吸率。

1.2.2 細胞凋亡監(jiān)測:H9C2細胞接種于6孔板,10%FBS高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(Gibco)24hrs后,加入含有大銀杏葉片(稀釋1/50,1/100,1/200)無糖無血清培養(yǎng)液(Gibco),放入缺氧小室和缺氧箱(95%N2/5%CO2)培養(yǎng)22 h后全培養(yǎng)基復(fù)氧2h,同時設(shè)正常對照和模型組。復(fù)氧后收集細胞并用預(yù)冷的PBS潤洗兩遍,再加入流式緩沖液重懸,然后加入Annexin V-FITC和PI兩種試劑在37℃下避光孵育15分鐘后染色10分鐘,再采用流式細胞儀檢測細胞熒光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理:采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖,所有數(shù)據(jù)均以(Mean±SD)表示,組間比較采用One-way ANOVA分析,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉片增加缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞的存活率及線粒體氧消耗量:MTT檢測結(jié)果顯示,缺氧復(fù)氧損傷后心肌細胞存活率下降到60%左右,加入銀杏葉片后能顯著提升細胞存活率(P<0.05),而且在1/50~1/200范圍內(nèi),隨著銀杏葉片濃度升高,心肌細胞存活率有升高趨勢。見圖1。

線粒體氧呼吸率試驗結(jié)果顯示,缺氧復(fù)氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量顯著下降,銀杏葉1/50劑量組顯著提升缺氧復(fù)氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量(P<0.05)。見圖2。

圖1 銀杏葉片增加缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞的存活率(n=6)

圖2 銀杏葉片增加缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞線粒體氧消耗量(n=6)

2.2 銀杏葉片抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞凋亡:流式細胞檢測凋亡結(jié)果顯示,銀杏葉1/50、1/100劑量組顯著抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞凋亡(P<0.05)。見圖3。

圖3 銀杏葉片抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞凋亡(n=3)

3 討論

隨著冠狀動脈搭橋術(shù)、溶栓術(shù)等急性心肌梗死治療技術(shù)的推廣,心肌細胞缺血再灌注損傷已經(jīng)成為影響急性心肌梗死患者治療效果與預(yù)后的重要研究指標(biāo)。心肌缺血再灌注損傷的主要原因有能量代謝障礙、過氧化損傷、鈣超載等,其中氧自由基生成導(dǎo)致的過氧化損傷是造成心肌細胞缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[3,4]。因此,急性心肌梗死治療中除了盡快恢復(fù)缺血組織的血流灌注外,應(yīng)重點考慮對缺血時間較長的心肌組織進行保護,以減少再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。

基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示,銀杏葉活性成分在心血管疾病的治療中表現(xiàn)出了很好的療效[5-6],Wang Z[7]等人通過心肌梗死模型的代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示,銀杏葉提取物可調(diào)節(jié)能量代謝,具有抗炎、抗氧化、降脂等多種功效;Zhang[8]等人對銀杏葉提取物EGb761進行觀察,發(fā)現(xiàn)其能通過調(diào)節(jié)ATM通路和細胞凋亡來保護缺氧/復(fù)氧損傷的微血管內(nèi)皮細胞。本次研究以已上市的藥物銀杏葉片為對象,采用缺氧復(fù)氧H9C2心肌細胞為模型。結(jié)果顯示,加入銀杏葉片保護后再對缺氧心肌細胞進行復(fù)氧,MTT實驗檢測結(jié)果顯示心肌細胞存活率顯著升高,而流式細胞檢測結(jié)果則顯示心肌細胞凋亡率顯著下降,可見,銀杏葉片能有效保護心肌細胞,抑制心肌細胞缺氧復(fù)氧后死亡。

心肌細胞缺氧復(fù)氧后會導(dǎo)致線粒體內(nèi)鈣超載及過氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致線粒體膜破裂,線粒體膜間的促凋亡因子大量釋放,并最終激活心肌細胞凋亡通路,促使大量心肌細胞損傷[9]。我們的線粒體氧呼吸率試驗結(jié)果顯示,缺氧復(fù)氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量顯著下降,銀杏葉片則可顯著提升缺氧復(fù)氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量,說明銀杏葉片對缺氧復(fù)氧心肌細胞的線粒體具有保護作用,其機制可能通過保護線粒體來抑制心肌細胞凋亡。

總之,我們通過初步研究證實銀杏葉片對缺氧復(fù)氧心肌細胞具有保護作用,能有效抑制缺氧復(fù)氧后心肌細胞凋亡,其作用機制可能與其對線粒體的保護作用有關(guān)。至于銀杏葉片對缺氧復(fù)氧心肌細胞保護的具體分子機制及動物水平驗證,還有待進一步研究。

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