高娟， 左文， 王璇，2

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）兒牙預(yù)防科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830000）；2. 新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830000）

牙外傷是兒童繼齲病后就診口腔科的第二大主訴疾病，也是臨床工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，其中全脫位牙（completely avulsion teeth，CAT）被認(rèn)為是最嚴(yán)重的一種。CAT 是指牙齒受到外力撞擊時(shí)完全脫出牙槽窩，牙周膜韌帶撕裂、牙髓組織喪失血供以及牙骨質(zhì)、牙槽骨造成損傷［1］。CAT 多見于7～14 歲的兒童，上頜中切牙最為好發(fā)［2］。目前，對(duì)于CAT 臨床首選的治療方法是牙再植術(shù)（tooth replantation，TR），該術(shù)可恢復(fù)牙周膜的血供和營(yíng)養(yǎng)支持，促進(jìn)牙周膜再生，從而實(shí)現(xiàn)全脫位牙再植成功。然而，TR 受多種因素影響，如患牙是否即刻再植、患牙脫離牙槽窩的時(shí)間、患牙保存媒介、牙根發(fā)育程度等，把握不當(dāng)均會(huì)導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致牙根表面牙周膜壞死，TR 成功率大大降低［3-4］。CAT 再植失敗會(huì)導(dǎo)致患牙缺失，不僅影響患兒口腔頜面部的生長(zhǎng)發(fā)育與咀嚼功能，而且影響其發(fā)音與美觀，對(duì)患兒的心理健康發(fā)展造成極大的影響。

近年來(lái)，關(guān)于慢性牙周炎再生牙周組織的研究越來(lái)越多，相對(duì)于慢性牙周炎的骨質(zhì)缺損和菌群復(fù)雜性而言，TR 是CAT 處于急性創(chuàng)傷期的對(duì)癥處理，以期實(shí)現(xiàn)理想的牙周膜愈合。因此，再生或重建牙周膜是實(shí)現(xiàn)CAT 牙周膜愈合的必要條件。能否利用現(xiàn)有的牙周組織再生技術(shù)，提高TR 的成功率，減少CAT 對(duì)患兒產(chǎn)生的不利影響，是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者共同探討的難題。本文就全脫位再植牙牙周組織再生的研究進(jìn)展作一綜述。

1 種子細(xì)胞

1.1 牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）

牙周膜（periodontal ligament，PDL）是圍繞牙根并連接牙根與牙槽骨的致密結(jié)締組織。牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLs）包括成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。其中最常見的是成纖維細(xì)胞，其主要功能是合成膠原、吞噬經(jīng)酶的水解而降解的舊膠原纖維，并具有牙周組織再生修復(fù)作用。Seo 等［5］2004 年首次提出PDLSCs 的概念，并發(fā)現(xiàn)PDLSCs 具有再生潛能。該研究通過(guò)克隆篩選和磁珠分離的方法獲得成體干細(xì)胞克隆株，發(fā)現(xiàn)PDLSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物Stro-1 和CD146/MUC18。該實(shí)驗(yàn)將PDLSCs 移植到免疫缺陷的大鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)表明PDLSCs 可向成牙骨質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膠原形成細(xì)胞等方向分化，且具有發(fā)育成牙骨質(zhì)-牙周膜樣結(jié)構(gòu)的潛能，在牙周組織修復(fù)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。Iwasaki等［6］在體外擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)增加，PDLSCs 的形態(tài)由紡錘體向扁平變寬，且PDLSCs 表現(xiàn)出多種肌成纖維細(xì)胞的特征，包括廣泛的應(yīng)力纖維形成、收縮活性和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，表明PDLSCs 在體外擴(kuò)增過(guò)程中自發(fā)分化向成纖維細(xì)胞，為臨床提供PDLSCs 培養(yǎng)條件的重要信息。另外，有研究者在PDLSCs 包裹牙齒再植構(gòu)建的模型中，將新的牙周膜纖維垂直插入新形成的骨組織，牙本質(zhì)表面觀察到新的鞘層形成，與對(duì)照組相比牙周組織愈合率較高。有研究探討了自體PDLSCs 在治療小型豬牙周炎中的作用，該實(shí)驗(yàn)研究將自體PDLSCs 與HA/TCP 組合移植到實(shí)驗(yàn)性誘發(fā)的小型豬牙周炎骨缺損中，結(jié)果顯示PDLSCs 介導(dǎo)組中牙槽骨的高度恢復(fù)到大約正常水平，而對(duì)照組的骨再生非常有限或沒(méi)有，表明PDLSCs 能夠再生牙周組織。

1.2 牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）

DPSCs 是從牙髓組織分離出的一類間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能［7］，可以生成血管、神經(jīng)以及牙齒軟硬組織（包括牙本質(zhì)、牙髓復(fù)合體、牙槽骨等）［8］。Jin 等［9］在DPSCs 和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞骨再生能力對(duì)比實(shí)驗(yàn)中表明：DPSCs 具有較強(qiáng)的集落形成能力、增殖能力、遷移能力和血管生成潛能。有研究者分離提取DPSCs 后，發(fā)現(xiàn)DPSCs 形態(tài)特征類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞且陽(yáng)性表達(dá)增值相關(guān)細(xì)胞因子如CD105、CD90、CD70，將DPSCs 回輸?shù)接忻庖呷毕莸男∈蠡蛲皿w內(nèi)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可形成牙本質(zhì)-牙髓樣復(fù)合體，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證了DPSCs 具有再生能力。

2 相關(guān)調(diào)節(jié)因子

2.1 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）

FGF-2 是促進(jìn)傷口愈合和再生的關(guān)鍵細(xì)胞因子，研究表明FGF-2 二聚體具有體外活性，可增加創(chuàng)面的肉芽組織和血管密度，改善傷口愈合過(guò)程中肉芽組織的形成，促進(jìn)傷口愈合［9］。Sang-Joun等［10］在建立的犬牙齒全脫位動(dòng)物模型中，使用FGF-2 溶液（30 μg/0.1 mL）處理后再植，術(shù)后4 周和8 周處死動(dòng)物進(jìn)行組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示：在損傷的牙根表面使用FGF-2 可以促進(jìn)犬牙齒置換后的牙骨質(zhì)形成，表明FGF-2 有效地促進(jìn)了損傷的牙周膜和牙骨質(zhì)的再生。目前研究表明，3～5 ng/mL 的FGF-2 可以促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。FGF-2 與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）對(duì)骨/骨形成分化的影響相反，并完全抑制BMP-2 和BMP-4 誘導(dǎo)的礦化，提示FGF-2 作為BMPs 的拮抗劑起主導(dǎo)作用，維持了PDLSCs早期韌帶分化的潛能。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖和遷移的潛能，對(duì)多種細(xì)胞的增殖、遷移和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。FGF 可以劑量依賴性地調(diào)節(jié)PDLSCs 的增殖，高濃度的bFGF 可以顯著抑制細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。Kang 等［11］證明了bFGF 和BMP-2 的順序應(yīng)用可以增加ALP 活性，促進(jìn)礦物質(zhì)沉積，上調(diào)與成骨相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，增強(qiáng)PDLSCs 的成骨能力。Xu 等［12］在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）和bFGF 組合促進(jìn)骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）介導(dǎo)的牙周膜再生的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了CAT 直接植入牙槽窩組，BMSCs 與支架材料材料結(jié)合植入牙槽窩組，以及將帶有犬BMSCs 的牙齒放入含有SDF-1 和bFGF（以空白培養(yǎng)基為對(duì)照）的溶液中放置3～4 d，然后合并牙齒用支架材料將其植入牙槽窩組，micro CT 三維圖像顯示SDF-1/bFGF組的牙周膜間隙更明顯，牙周膜愈合率最高，根吸收率最低，表明SDF-1 和bFGF 結(jié)合促進(jìn)CAT 再植牙牙周膜再生。

2.2 溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）

LPA 是人體內(nèi)存在的血清生長(zhǎng)因子，是一種衍生自磷脂的信號(hào)分子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移，具有促/抗炎、促/抗凋亡的作用，對(duì)牙周韌帶有一定調(diào)節(jié)作用［13］。Kim 等［14］研究表明10 μmol/L LPA 可以促進(jìn)PDLSCs 增殖，增強(qiáng)PDLSCs的存活率。有研究表明LPA 通過(guò)控制細(xì)胞粘附、遷移和分化來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)能力。該研究還表明LPA 通過(guò)加速損傷組織的修復(fù)，將DPSCs 從缺血誘導(dǎo)的凋亡中置換出來(lái)，證明LPA 可以促進(jìn)DPSCs 增殖。另外，亦有報(bào)道表明LPA 通過(guò)調(diào)控牙齦成纖維細(xì)胞相關(guān)基因調(diào)節(jié)牙周組織炎癥，促進(jìn)傷口愈合［15］。

2.3 釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix protein，EMPs）

EMPs 是由上皮根鞘分泌的一種可以調(diào)控牙齒礦化的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，研究表明，EMPs 可以促進(jìn)牙周組織再生、降低牙根吸收率［16］。有研究者用含有不同質(zhì)量濃度EMPs 的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)hPDLSCs，結(jié)果顯示低于100 mg/L EMPs 可以促進(jìn)hPDLSCs 的增殖和細(xì)胞活性，當(dāng)EMPs 濃度高于100 mg/L 時(shí)則表現(xiàn)為抑制作用。而在PDLSCs 體外創(chuàng)傷愈合模型中，100 mg/L EMPs 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)緣完全關(guān)閉，優(yōu)于其他質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，表明EMPs 可以促進(jìn)牙周組織再生。研究表明，Ⅰ型膠原蛋白（collagen I，Col-I）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）與牙周膜的再生和重塑有關(guān)，Zou 等［17］將100 μg/mL 的EMPs 和50 kPa的機(jī)械刺激相結(jié)合可顯著刺激牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖并提高Col-I 和MMP-1 的表達(dá)水平，表明EMPs 在牙周組織再生中具有重要作用。

2.4 白介素-6（interleukin-6，IL-6）

IL-6 是宿主受到若干刺激時(shí)產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，傳遞防御信號(hào)，刺激急性期反應(yīng)、免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化，參與神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，在宿主免疫防御中起著非常重 要 的 作 用［18］。Liu 等［19］將B 細(xì) 胞 與hPDLSCs 或hBMSCs 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上清液中IL-6 的濃度均高于這3 種細(xì)胞各自單獨(dú)培養(yǎng)的濃度。當(dāng)培養(yǎng)液中IL-6 濃度為0、50、100 和200 ng/ml 時(shí)，用抗IL-6 抗體中和IL-6 后對(duì)B 細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，而添加抗IL-6 單克隆抗體后，凋亡B 細(xì)胞的百分比以濃度依賴性的方式顯著增加，表明hPDLSCs 可能通過(guò)IL-6 抑制B 細(xì)胞凋亡。PD-1 是在活化的T 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的抑制共刺激分子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答和外周耐受的調(diào)節(jié)。該實(shí)驗(yàn)使用針對(duì)PD-1，PD-L1 和PD-L2 的單克隆抗體進(jìn)行了封閉實(shí)驗(yàn)，證明了PDLSCs 通過(guò)體外的PD-1 和PD-L1 相互作用抑制了B 細(xì)胞的增殖。B 細(xì)胞的活化受T 細(xì)胞的影響，而T 細(xì)胞受hPDLSCs 抑制，異體PDLSC 移植的動(dòng)物缺乏體液免疫排斥反應(yīng)。因此，抑制B 細(xì)胞功能與抑制T 細(xì)胞活化相結(jié)合，進(jìn)一步支持了異體PDLSCs 的使用可能是牙齒再生和牙周膜重建的一種新方法。

2.5 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）

甘露糖是一種C-2 葡萄糖的表聚物，目前已發(fā)現(xiàn)D-甘露糖的T 細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，D-甘露糖通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)刺激Tregs 分化［20-21］。Guo 等［21］將經(jīng)葡萄糖或甘露糖預(yù)處理的PDLSCs 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)甘露糖預(yù)處理的PDLSCs（M-PDLSCs）比葡萄糖預(yù)處理的PDLSCs（G-hPDLSCs）對(duì)T 細(xì)胞增殖的抑制能力更強(qiáng)。與此同時(shí)，該研究在T 細(xì)胞+M-hpdlscs 共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)了更多的Foxp3+T 細(xì)胞，F(xiàn)oxp3 是Tregs 最重要的分子標(biāo)記物，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞與Treg 正相關(guān)，表明M-hPDLSCs 誘導(dǎo)更多的T細(xì)胞分化為Tregs。該研究組篩選了不同的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)：T 細(xì)胞+ M-hPDLSC 共培養(yǎng)體系中IL-6 明顯較低，故將T 細(xì)胞+ G-hPDLSCs/T + MhPDLSC 混合細(xì)胞回植裸鼠體內(nèi)，結(jié)果表明D-甘露糖通過(guò)抑制hPDLSCs 中的IL-6 誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Tregs。IL-6在調(diào)節(jié)Treg/Th17 平衡中起著非常重要的作用。Tregs 介導(dǎo)免疫耐受，Th17 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，二者相互拮抗，保持機(jī)體免疫動(dòng)態(tài)平衡。此外，Treg 被激活之后，可以抑制B 細(xì)胞，殺傷細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體處于感染狀態(tài)時(shí)，Treg 通過(guò)調(diào)節(jié)殺傷病原體的T 細(xì)胞和引起過(guò)度炎癥反應(yīng)的T 細(xì)胞之間的平衡發(fā)揮作用，該研究發(fā)現(xiàn)了d-甘露糖和IL-6 在hPDLSC 免疫調(diào)節(jié)中的新功能，為PDLSCs 再生牙周組織提供新的可能。

3 支架材料的應(yīng)用

支架材料通常作為細(xì)胞的載體，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化提供一個(gè)良好的微環(huán)境。理想的支架材料應(yīng)滿足：生物相容性，生物降解性和類似于細(xì)胞自然環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)。目前支架材料廣泛應(yīng)用于牙周組織再生，為細(xì)胞黏附和增殖提供了三維生長(zhǎng)空間［22］。

3.1 自體生物材料

有研究者分離犬PDLSCs，并將牙根作為攜帶PDLSCs 的支架，根據(jù)是否涂布纖維連接蛋白和（或）磷酸鈣表面涂層分組，研究表明：纖維連接蛋白和（或）磷酸鈣增加了PDLSCs 在牙根表面的黏附，可以促進(jìn)PDLSCs 黏附在牙根表面產(chǎn)生新的牙周附著體。

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是一種富含細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的自體生物材料。Yang 等［23］在 犬CAT 再 植 時(shí) 采 用 富 血 小 板 血 漿（platelet-rich plasma，PRP）浸泡，表明PRP 的應(yīng)用可以減輕牙固連，增加牙周膜樣和牙骨質(zhì)樣組織的形成。Du 等［24］在大鼠牙周組織骨缺損模型中，設(shè)置黏骨膜瓣覆蓋缺損的對(duì)照組，PRF 組和PRF/阿司匹林復(fù)合物實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行研究，結(jié)果表明：PRF/阿司匹林復(fù)合物可為增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和生存能力提供適宜的理化微環(huán)境，并在移植早期通過(guò)抗炎藥物保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞不受宿主免疫系統(tǒng)的影響。PRF 和PRF/阿司匹林復(fù)合物均能促進(jìn)大鼠牙周組織再生，但PRF/阿司匹林復(fù)合物的作用比PRF 更明顯，為促進(jìn)牙周組織再生提供了新的理論依據(jù)，為CAT 再植提供了新的思路。

3.2 人工合成材料

3.2.1 納米支架材料 HydroMatrix（HydM）是近年來(lái)開發(fā)用于細(xì)胞培養(yǎng)的新型可注射肽納米纖維水凝膠。Nagy 等［25］將PDLSCs 接種在未涂布或涂有HydM 的表面上，生長(zhǎng)阻抗測(cè)定和細(xì)胞活力測(cè)定都表明PDLSCs 能夠在HydM 上粘附和增殖；ALP 活性和von Kossa 染色證明PDLSCs 可以在HydM 凝膠上黏附、遷移、存活、增殖和分化成骨，表明HydM是PDLSCs 再生應(yīng)用可利用的材料。有學(xué)者將培養(yǎng)的PDLSCs 誘導(dǎo)成骨并附著在雙相磷酸鈣支架上，然后將附著有PDLSCs 的支架材料移植到犬體內(nèi)。結(jié)果顯示：附著有PDLSCs 的支架材料可促進(jìn)新生骨形成和新生膠原纖維以直角插入鄰近牙骨質(zhì)和骨，且再生組織有豐富的血管生成，表明PDLSCs 結(jié)合支架材料是牙周組織再生方法中非常有應(yīng)用前景的方法。

3.2.2 Bio-Oss 顆粒 有研究者構(gòu)建犬牙周炎骨缺損模型，對(duì)照組植入Bio-Oss 顆粒，而實(shí)驗(yàn)組則植入等量的載有P3DPSCs 的Bio-Oss 顆粒，結(jié)果表明：兩組均有新牙骨質(zhì)，牙周膜和骨組織的形成，實(shí)驗(yàn)組再生牙骨質(zhì)比對(duì)照組的厚，覆蓋了較大的根部表面，而對(duì)照組骨質(zhì)較少且分散，表明DPSCs 結(jié)合生物材料能夠再生牙周組織修復(fù)牙周缺損。

4 展 望

目前國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證明多種種子細(xì)胞可以再生牙周組織，而相關(guān)調(diào)節(jié)因子和支架材料的應(yīng)用可以促進(jìn)種子細(xì)胞再生牙周組織。將現(xiàn)有的牙周組織再生技術(shù)運(yùn)用在CAT 再植中，促進(jìn)牙根周圍及牙槽窩中的牙周組織再生，從而實(shí)現(xiàn)CAT 成功再植，為臨床工作提供理論指導(dǎo)。