向文彬，陳俊宏,2，嚴紅亞，李珂，覃袖偉，趙蓉，李會,2，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201)

包涵體肝炎性-心包積水綜合征(Inclusion body hepatitis-hydropericardial syndrome，IBH-HPS)是由禽腺病毒(Fowladenovirus，F(xiàn)AdV)引起的一種嚴重危害禽類養(yǎng)殖的疾病，尤其是3～6周齡的肉雞，其發(fā)病突然，死亡率高，一般為20%～70%，病理解剖可見典型的心包積液和肝臟腫大出血[1，2]。本病既可橫向傳播又可垂直傳播，其傳播的主要途徑是通過糞口途徑。被感染禽類的肝臟在顯微鏡下顯示肝細胞中有明顯壞死灶和嗜堿性核內(nèi)包涵體[2]。根據(jù)當前病毒分類系統(tǒng)，禽腺病毒可分為3個亞群，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切分析可分為5個型，即FAdV-A～FAdV-E；根據(jù)血清交叉中和實驗可分為12個血清型，即FAdV-1～FAdV-8a、FAdV-8b～FAdV-11。Ⅱ群禽腺病毒包括火雞出血性腸炎病毒、雉雞大理石脾病毒和禽類脾腫大病毒。Ⅲ群禽腺病毒僅包含減蛋綜合征病毒(Eggdropsyndromevirus，EDSV)[2，3]。最常見的是Ⅰ群禽腺病毒中的FAdV-4型感染。在國內(nèi)該病先后出現(xiàn)在遼寧、安徽、山東、浙江等地[4]，最近幾年也在西南地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)[5]。目前，云南省禽腺病毒流行情況尚缺乏相關(guān)報道和調(diào)查，本次流行病學調(diào)查可為今后云南省禽腺病毒的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DL2000 DNA Marker購自天根生化科技有限公司，rTaq酶購自上海捷瑞生物工程有限公司,瓊脂糖購自上海斯信生物科技有限公司。電泳儀購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司，凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 病料來源

對來自云南省內(nèi)疑似禽腺病毒感染的發(fā)病禽類進行剖檢，采取心臟、肝臟、脾臟、心包積液等組織樣品共50份，送至云南省畜牧獸醫(yī)科學院養(yǎng)禽與禽病研究所實驗室進行分子生物學檢測及基因序列測定與分析。

1.3 臨床剖檢

將病死禽進行臨床解剖后觀察其病理變化。

1.4 PCR檢測

根據(jù)GenBank中收錄的FAdV全基因組序列，針對病毒的Hexon基因的保守序列設(shè)計合成了1對特異性引物用于病毒檢測及分子流行病學研究。引物序列為上游F：5′-ATGTCAGCAGTAGGCGAT-3′，下游R：5′-GCCGTCGCTCTAAGGGTC-3′，預期擴增1218bp，引物由擎科生物公司合成。對臨床采集樣品進行PCR檢測。檢測反應(yīng)體系為25μL：rTaq酶12.5μL，ddH2O10.5μL，DNA模板1μL，上游引物、下游引物各0.5μL；PCR反應(yīng)條件為94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，60s，35個循環(huán)；72℃，7min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 Hexon基因的同源性比較和聚類分析

將陽性PCR擴增產(chǎn)物純化后進行Hexon基因序列測定，并用Vector NTI 8 軟件拼接，從GenBank下載有關(guān)禽腺病毒的相關(guān)序列作為參考毒株(見表1)，采用MEGA 6.0軟件，進行同源性比較和聚類分析。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢結(jié)果

臨床解剖可見病死雞心包積液，心包囊中積聚無色或琥珀綠色，水狀或果凍狀液體，心包整個呈現(xiàn)透明水荔枝狀的形態(tài)，其內(nèi)大約有10～30mL液體，心臟出現(xiàn)畸形和凹陷，心尖在心包囊中浮起，心包脂肪顯示出淡黃色變色和瘀血；肝臟極度腫大，質(zhì)脆易碎，有大面積的局灶性壞死斑塊和上皮出血；脾臟腫大；肺臟瘀血、水腫；腸道出血；雞胃角質(zhì)層糜爛。

2.2 PCR結(jié)果

經(jīng)PCR檢測的所有樣品中有3個可擴增出Hexon片段(1211bp)，禽腺病毒核酸檢測陽性，見圖1、圖2。

M.DNA標準DL2000；1.陽性對照；2.陰性對照；3.FAdV-D11 YN20191128DUCK；4～7.樣品。

M.DNA標準DL2000；1.陽性對照；2.陰性對照；3.FAdV-C4 YN20200320；4.FAdV-E8YN20191031；5～7.樣品。

2.3 Hexon基因序列測定與結(jié)果分析

通過Vector NTI 8軟件進行序列拼接，然后使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進化樹比對測序結(jié)果。結(jié)果顯示，檢測的樣品中編號YN20191128 FAdV-D樣品與D11血清型參考毒株序列同源性為100%，編號YN20200320 FAdV-C樣品與C4血清型參考毒株序列同源性為99.67%，編號YN20191031 FAdV-E樣品與血清型為E8b參考毒株序列同源性為99%。說明目前的檢測范圍中云南省流行的禽腺病毒毒株主要為C4型、D11型、E8b型(結(jié)果見圖3)；暫未發(fā)現(xiàn)其他血清型毒株。

3 討論

禽腺病毒最早于20世紀70年代中期在我國臺灣省出現(xiàn)，其主要流行型以血清Ⅰ型為主，臨床癥狀不典型，病理學變化多為心包積液和包涵體肝炎。隨著病毒的傳播與突變，禽腺病毒感染已經(jīng)成為當前養(yǎng)禽業(yè)疾病防控中不可忽視的一個重要問題。本次對云南省禽腺病毒流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)云南省養(yǎng)禽業(yè)存在禽腺病毒，并呈流行趨勢，主要流行毒株基因型集中為FAdV-C4型、FAdV-D11型、FAdV-E8型，其中FAdV-D11型主要存在于鴨類，其他流行毒株存在于土雜雞和商品代蛋雞。將繼續(xù)對云南省內(nèi)的禽腺病毒流行情況進行跟蹤調(diào)查。

臨床剖檢方面，若病死禽出現(xiàn)典型心包積液與肝炎癥狀可懷疑為Ⅰ型禽腺病毒感染；若蛋禽出現(xiàn)明顯產(chǎn)蛋下降并排除細菌類感染、新城疫等疾病時可懷疑Ⅲ型禽腺病毒感染，但若要確診仍然需要進行分子生物學檢測。

通過對PCR陽性產(chǎn)物的Hexon基因序列對比分析后發(fā)現(xiàn)，云南省流行的禽腺病毒主要是FAdV-C4型，通過對比GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)參考毒株，與我國山東以及加拿大分離株的同源性高達99.67%。當然禽腺病毒的隱性感染率很高，這對普通的分子生物學檢測方法也造成了不可避免的誤差[6]。

禽腺病毒在云南省內(nèi)的流行已經(jīng)不局限于偶發(fā)性發(fā)病，這提示在實際生產(chǎn)中應(yīng)該從阻斷傳染源、切斷傳播途徑方向入手，在引進種禽時必須建立嚴格的隔離凈化制度[7]，將新引入的種禽分群在距離原先禽舍較遠的地方進行隔離觀察飼養(yǎng)，有條件的應(yīng)該進行全面血清學檢測，如檢測中遇到陽性群體應(yīng)將其單獨隔離進行飼養(yǎng)管理，并安全銷毀病死禽。對未患病禽進行免疫預防，平時應(yīng)該嚴格執(zhí)行衛(wèi)生消毒工作，對圈舍、飼料和飲水進行徹底的消毒，因為如其他疾病伴發(fā)時容易引起相關(guān)的免疫抑制病，從而引起交叉感染加劇病情惡化程度[8]。

目前，市面上也有很多關(guān)于禽腺病毒的疫苗，如油乳劑細胞滅活苗、全病毒滅活疫苗、弱毒滅活苗和亞單位疫苗[9]。選擇與流行毒株基因型相匹配的油乳劑細胞滅活苗，對該病也能較好保護，且這種保護作用能傳遞給免疫禽的子代，對免疫禽及其子代的保護率分別達到100%和90%[10]。除此以外，還需要對原種場、祖代場等進行禽腺病毒的凈化，才能有效地切斷傳播途徑，減少該病毒的感染。

圖3 禽腺病毒核酸序列的進化樹