王天葆，李會(huì)，李珂，嚴(yán)紅亞，覃袖偉，向文彬，陳俊宏，趙蓉*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224； 2.廣南縣舊莫鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，云南 廣南 663302； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

支原體(Mycoplasma)是一類(lèi)具有獨(dú)立生活能力的小型原核微生物，廣泛存在于自然界，是人和動(dòng)物常見(jiàn)的病原菌之一。禽支原體感染呈世界性分布，雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)和滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)感染被認(rèn)為是幾個(gè)國(guó)家家禽業(yè)的特有病[1]。在我國(guó)，支原體病被列為二類(lèi)傳染病，除雞毒支原體外，多個(gè)省市地區(qū)都有滑液囊支原體感染的報(bào)道。MS可通過(guò)直接接觸、媒介生物、飼料、飲水等橫向感染，又可經(jīng)雞胚垂直傳播。垂直傳播是其主要感染途徑，傳播率可達(dá)100%[2]。

MS是引起雞和火雞出現(xiàn)急性或慢性傳染性關(guān)節(jié)炎的一種重要病原,對(duì)關(guān)節(jié)、滑液囊及呼吸道組織有親嗜性,主要引起雞、火雞呼吸道疾病、傳染性滑膜炎、關(guān)節(jié)腫大變形和實(shí)質(zhì)器官腫大，造成雞只跛行或癱瘓。研究表明，雞體感染MS后抗體反應(yīng)緩慢,呈現(xiàn)周期性排毒,水平傳播能力強(qiáng)[3]。多數(shù)情況下，感染雞不表現(xiàn)典型臨床癥狀，僅少部分雞只出現(xiàn)典型臨床癥狀，慢性和無(wú)癥狀感染更常見(jiàn)，可引起雞群死淘率增高、飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)緩慢、胴體降級(jí)、蛋品質(zhì)降低，使肉雞綜合生產(chǎn)的成本增加，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

臨床上MS感染不是引起家禽死亡的直接原因,但由于其難根除性,且潛伏期較長(zhǎng)，造成雞群持續(xù)性感染，在動(dòng)物體抵抗力降低時(shí)加劇其他病原的致病力,增加死亡率。

近年來(lái)，隨著云南省養(yǎng)禽業(yè)的不斷發(fā)展和雛禽的不斷引進(jìn)，禽病的發(fā)生與流行更為錯(cuò)綜復(fù)雜，MS已經(jīng)成為云南省養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重大安全隱患。為全面了解其發(fā)生發(fā)展情況及流行規(guī)律，有效預(yù)防控制，對(duì)云南省部分規(guī)模化養(yǎng)禽場(chǎng)MS的流行情況進(jìn)行了調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來(lái)源

48份疑似MS臨床樣品來(lái)自昆明市、大理州、紅河州、普洱市等地區(qū)送檢的養(yǎng)殖場(chǎng)雞病變組織及關(guān)節(jié)液。血清樣品368份，用隨機(jī)抽樣法采自昆明市、玉溪市、大理州、曲靖市、西雙版納州、昭通市、普洱市不同規(guī)模的養(yǎng)雞場(chǎng)，翅靜脈采集不同品種、不同日齡雞群的血樣。其中肉雞血清樣品124份，采自6個(gè)公司8個(gè)不同品種，59～110日齡；蛋雞血清樣品244份，采自7個(gè)公司7個(gè)不同品種，33～480日齡。其中部分處于發(fā)病初期或中期，部分處于發(fā)病高峰期。

1.1.2主要試劑及儀器

組織基因組DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DNA Maker DL1000購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，荷蘭BioChek公司的雞滑液囊支原體(MS)抗體檢測(cè)試劑盒，ELISA洗板機(jī)、ELISA讀板儀和PCR儀(基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀)購(gòu)自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司，型號(hào)為GENESY P6T。電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，凝膠成像紫外儀購(gòu)自Tanon天能公司，型號(hào)為T(mén)anon 3500。

1.2 方法

1.2.1臨床樣品的PCR鑒定

按照組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取組織和關(guān)節(jié)液基因組DNA。參照GenBank登陸的MS基因序列，設(shè)計(jì)引物(上游F:5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；下游R:5′-GTCGTCTCGAAGTTAACAA-3′)，擬擴(kuò)增片段大小為207 bp[4]。PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；4℃保存。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

1.2.2ELISA血清抗體檢測(cè)

無(wú)菌采集雞抗凝血，分離血清用于檢測(cè)抗體。按照荷蘭BioChek公司的雞滑液囊支原體抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血清樣品檢測(cè)。血清在96孔ELISA板中進(jìn)行稀釋，稀釋度為1:500，陰性、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)兩孔，在包被板上作用一定時(shí)間后依次加入各種酶和底物試劑，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD405nm)，用S/P值(樣品與陽(yáng)性對(duì)照的比值)來(lái)表示抗體，S/P值≥0.5，判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷及剖檢變化

病雞兩側(cè)跗關(guān)節(jié)處有黃色干酪樣滲出物，明顯腫脹突出，癱瘓或跛行，局部溫度升高，觸之有波動(dòng)感。剖開(kāi)流出大量關(guān)節(jié)液，實(shí)質(zhì)器官腫脹不明顯。

2.2 PCR病原檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，48份疑似MS臨床樣品中有10份樣品出現(xiàn)與預(yù)期符合的207bp條帶，經(jīng)測(cè)序后，NCBI Blast比對(duì)與已知MS序列相似度達(dá)到98%，陽(yáng)性率為20.83%。部分樣品檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

M.DNA Maker DL1000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3～4.檢測(cè)樣品。

2.3 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1不同公司雞滑液囊支原體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

檢查來(lái)自不同地區(qū)的13個(gè)公司中皆存在不同水平的MS感染，血清陽(yáng)性率為4.17%～100%，平均陽(yáng)性率高達(dá)68.48%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同公司雞滑液囊支原體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.3.2不同品種雞滑液囊支原體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

抽檢的肉雞和蛋雞共15個(gè)品種均有不同水平的感染，肉雞中除品種5由于正處在發(fā)病高峰期，血清抗體未檢測(cè)出外，其余7個(gè)品種感染率在43.48%～100.00%，蛋雞不同品種感染率在46.51%～95.00%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 肉雞、蛋雞不同品種雞滑液囊支原體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.3.3蛋雞和肉雞不同日齡雞群雞滑液囊支原體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

抽檢的雞群中普遍存在MS感染，其中，肉雞和蛋雞的血清平均陽(yáng)性率分別為64.52%和70.49%；不同日齡雞群之間感染率存在一定差異，除肉雞呈現(xiàn)感染率隨日齡增大而增高的趨勢(shì)外，蛋雞感染率分布無(wú)明顯規(guī)律性，各日齡雞血清陽(yáng)性檢出率詳見(jiàn)表3。

表3 肉雞、蛋雞不同日齡雞滑液囊支原體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

3 討論

3.1 高感染率原因分析

通過(guò)對(duì)不同雞場(chǎng)MS血清學(xué)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)MS感染普遍存在，血清平均陽(yáng)性率達(dá)68.48%。根據(jù)抽檢雞場(chǎng)的實(shí)際情況，發(fā)現(xiàn)這些雞場(chǎng)的環(huán)境條件與飼養(yǎng)管理普遍達(dá)不到規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)的標(biāo)準(zhǔn)，而陽(yáng)性檢出率低的雞場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境與管理水平相對(duì)較好。說(shuō)明MS感染與飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件密切相關(guān)，提示養(yǎng)殖者應(yīng)特別注意優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，提高飼養(yǎng)管理水平。

通過(guò)對(duì)不同品種雞的MS血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)雞群感染無(wú)品種間特異性，不同品種的雞群均可感染MS，表明雞群感染主要還是與環(huán)境和管理等外在因素有關(guān)，部分品種陽(yáng)性檢出率相對(duì)較低。除上述因素外，是否與種雞感染程度、雞種源、不同品種對(duì)MS存在一定抗性有關(guān)，有待進(jìn)一步調(diào)查[5]。

通過(guò)分析蛋雞和肉雞不同日齡雞群感染MS的情況，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是蛋雞還是肉雞均有感染，兩者的血清平均陽(yáng)性率均在60%以上，蛋雞感染比肉雞感染嚴(yán)重,表明垂直傳播還是其主要感染途徑；從日齡方面來(lái)看，肉雞感染隨年齡的增大而有所增加，蛋雞感染在年齡上無(wú)規(guī)律性，可能由于蛋雞飼養(yǎng)周期較長(zhǎng)，存在交叉感染和持續(xù)感染等風(fēng)險(xiǎn)。值得注意的是，200日齡以上的蛋雞雞群血清陽(yáng)性檢出率均在90%以上，且存在日齡愈大陽(yáng)性率愈高的趨勢(shì)?？傮w結(jié)果顯示，云南雞場(chǎng)MS感染存在嚴(yán)重態(tài)勢(shì)，應(yīng)引起足夠重視。

3.2 云南本地防控現(xiàn)狀

對(duì)云南部分地區(qū)13個(gè)不同養(yǎng)雞場(chǎng)MS血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示云南MS感染陽(yáng)性率顯著高于其他省市的報(bào)道，流行情況較為嚴(yán)重，原因可能與采集的樣品數(shù)量有一定關(guān)系，但雞群中普遍存在MS的感染，應(yīng)引起重視。由于不同地區(qū)流行的MS菌株存在基因型差異，目前，國(guó)內(nèi)MS疫苗使用效果達(dá)不到預(yù)期，云南省各大雞場(chǎng)主要依靠投喂藥物來(lái)預(yù)防控制。結(jié)合臨床實(shí)際情況，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用藥物難以較好地控制MS感染，因此采取綜合防治措施是必要的。

3.3 MS綜合防控措施

3.3.1構(gòu)建生物安全體系

回溯調(diào)查雞群場(chǎng)群，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖環(huán)境與MS感染密切相關(guān)，降低感染風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)從養(yǎng)殖環(huán)境入手，改善養(yǎng)殖設(shè)施條件，制定切實(shí)合理的養(yǎng)殖方案，構(gòu)建綜合的生物安全體系。生物安全體系是投入小、受益大的防疫屏障，應(yīng)從源頭抓起，科學(xué)選址，合理布局，凈道、污道分離，做好消毒隔離工作，加裝通風(fēng)、控溫設(shè)施，添置滅蚊蠅燈、擋鼠板、防鳥(niǎo)網(wǎng)等。

3.3.2強(qiáng)化管理，合理用藥

制定合理的飼養(yǎng)管理方案，采取全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，單一日齡飼養(yǎng)，保持雞群良好的均勻度，做好季節(jié)和天氣變化時(shí)的通風(fēng)和控溫工作，疫病發(fā)生時(shí)的隔離消毒和病死雞處理工作。制定有效的免疫程序和用藥方案，定期帶雞消毒。該病治療效果不明顯，但將四環(huán)素類(lèi)、吡酮酸類(lèi)、支原凈或強(qiáng)力霉素等敏感藥物混于飼料和飲水中可有效降低MS的感染風(fēng)險(xiǎn)，其中，恩諾沙星被認(rèn)為有較好的臨床效果[6]。用藥之前做藥敏試驗(yàn)，選擇最敏感的藥物，并嚴(yán)格遵守休藥期，有條件的雞場(chǎng)應(yīng)疫苗免疫結(jié)合藥物治療加以防治。

3.3.3加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，凈化種源

培育優(yōu)質(zhì)雞群，首先要做好引種的檢疫工作，不從疫點(diǎn)疫區(qū)或支原體感染嚴(yán)重的地方引種，從原種開(kāi)始持續(xù)做好疾病凈化工作。其次，飼養(yǎng)管理過(guò)程中在實(shí)行嚴(yán)格的生物安全措施的基礎(chǔ)上做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、定期檢查，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)陽(yáng)性雞進(jìn)行淘汰、免疫或用藥處理。有研究指出，雞胚傳播是MS感染的主要途徑，MS理應(yīng)被加入種禽場(chǎng)檢疫對(duì)象行列，作為必檢項(xiàng)目[7]，為了控制支原體通過(guò)雞胚代代相傳，孵育雛雞之前必須對(duì)種蛋進(jìn)行處理。

綜上所述，云南省MS感染現(xiàn)狀十分嚴(yán)重，應(yīng)引起高度重視，防止感染率繼續(xù)飆升。應(yīng)建立PCR檢測(cè)方法，針對(duì)病原體的引物和探針設(shè)計(jì)完整的檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證一種行之有效的支原體臨床診斷技術(shù)；廣泛開(kāi)展血清學(xué)檢測(cè)，在監(jiān)測(cè)疾病的同時(shí)也可為云南省MS血清流行病學(xué)的調(diào)查提供數(shù)據(jù)支撐；綜合防制措施不可忽視，生物安全和藥物預(yù)防是養(yǎng)禽場(chǎng)防控滑液囊支原體和其他疾病必不可少的條件，應(yīng)嚴(yán)格把關(guān)，促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。