黃麗萍,高麗娟
(遼寧科技大學 化學工程學院,遼寧 鞍山 114051)
多糖(Polysaeeharides)是一種天然的高分子化合物,在生命活動的維持中有著無法替代的作用。植物活性多糖具有多種藥理活性,成為天然藥物研究的熱點之一。
爬山虎[1],葡萄科爬山虎屬,原產(chǎn)美國東部[2],在綠化中已得到廣泛應(yīng)用,落葉資源極其豐富。爬山虎的莖、葉、果實、種子等處均含有植物多糖。夏秋紅[3]等測定爬山虎的果、莖、葉中的多糖含量分別為6.39%、21.88%、11.77%。梁曉霞[4]研究發(fā)現(xiàn),通過陰離子交換和凝膠色譜法從爬山虎的莖中提取得到多糖,當多糖濃度達到一定值時,對自由基的抑制作用與丁基羥基甲苯相當,對細菌和真菌均具有抑制作用。董愛文[5]研究發(fā)現(xiàn),爬山虎多糖對細菌和真菌均有一定抑制作用,而且根、莖中所含多糖比其果實中多糖的抑制作用更強。但沒有文獻報道爬山虎落葉中多糖的功效如何,這與落葉中成分復(fù)雜,提取純化達到一定濃度很困難有關(guān)。
植物多糖常以水煎法、酸堿溶液浸提法、乙醇溶液浸提法,配合微波或超聲輔助法進行粗提[6-8],同時利用植物多糖難溶于高濃度乙醇,采用水溶醇沉法對多糖提純,并確定其純度[9-10]。本文采用溶劑浸提法,并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化爬山虎落葉中多糖的提取工藝,以期對爬山虎落葉中多糖資源的綜合利用提供試驗依據(jù)。
爬山虎落葉除去表面的浮塵、烘干、粉碎粒徑小于0.178 mm,備用。
取5 g預(yù)處理原料,加入一定量的浸提劑,在一定溫度下靜置浸提一定時間后過濾,取濾液蒸出溶劑,即得多糖提取物。
1.3.1 苯酚-硫酸-分光光度法定量測定多糖從質(zhì)量濃度為160 μg/mL的蔗糖標準溶液中分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL置于10 mL容量瓶中,加蒸餾水補齊至4 mL,再分別加入50 g/L的苯酚1 mL和濃硫酸5 mL,混勻,靜置20 min。用722s可見分光光度計,在490 nm波長下測吸光度,擬合得到蔗糖標準曲線方程為
式中:A為吸光度;C為測試液體質(zhì)量濃度,μg/mL。
1.3.2 爬山虎落葉中多糖含量測定 準確量取濾液體積V(mL),將濾液配制成適當質(zhì)量濃度的多糖溶液,準確吸取樣品液1 mL于10 mL容量瓶,測吸光度。根據(jù)式(1)計算多糖濃度C(g/mL)。多糖提取率Y計算式
式中:m為爬山虎干葉質(zhì)量,g。
單因素法考察影響多糖提取率的4個因素:浸提時間、浸提溫度、浸提劑乙醇體積分數(shù)和液料比,實驗結(jié)果如圖1所示。
隨著提取時間的延長和溶劑乙醇體積分數(shù)的增加,多糖提取率都先增加后減少,出現(xiàn)極大值。因為隨著提取時間的延長,落葉中溶解速率慢的組分也有了大量的溶解,對多糖的檢測產(chǎn)生了影響。多糖不溶于乙醇,隨著乙醇含量的增加,多糖在溶液中的溶解度減小,所以濾液中檢測到的多糖量減少。
隨著提取溫度的升高多糖提取率先快速增加,后緩慢增加。因為溫度升高可以提高分子的擴散速率,相同時間內(nèi)提高提取率。
隨液料比的增加,多糖提取率先快速增加,后趨于不變。這是因為在原料中含有的多糖量是確定的,在多糖沒有被最大量提取之前,溶劑量增加,可溶解的多糖增加,提取率也增大,但當原料中的多糖最大量提取之后,再增加溶劑,提取率則不再增加。
圖1 單因素對提取率的影響Fig.1 Effects of single factor on extraction rate
所以單因素優(yōu)選工藝:提取時間為120 min,提取溫度不宜超過100℃,液料比10 mL:1 g,乙醇體積分數(shù)40%。
對濾液濃縮干燥,放入少量水溶解完全,加入兩倍體積的無水乙醇進行醇沉提純,靜置過夜后過濾,濾餅干燥得到多糖。重復(fù)上述提純過程4次,分別測定醇沉后多糖純度。
提純次數(shù)對多糖純度的影響曲線見圖2。在提純2次時,純度達到最大33.56%,相較于第一次純度提高了17.63%,繼續(xù)增加提純次數(shù),純度幾乎不變。為了提高效率,對多糖提純2次即可。
圖2 提純次數(shù)對多糖純度的影響Fig.2 Effects of purification times on polysaccharides purity
以單因素實驗結(jié)果為依據(jù),在乙醇體積分數(shù)為40%,提取次數(shù)為一次,根據(jù)提取溫度、提取時間、液料比3個單因素為自變量進行組合優(yōu)化。3個因素及每個因素的水平見表1。為討論以上各因素協(xié)同作用對提取率的影響,采用Disign-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken Design(BBD)實驗方法設(shè)計了三因素共17個實驗點的響應(yīng)面試驗,詳見表2。
表1 Box-Behnken Design實驗因素和水平Tab.1 Experimental factors and levels of Box-Behnken Design
利用Design-Expert 8.0.6分析數(shù)據(jù),對提取率Y構(gòu)建多項式多元線性回歸方程
Y=4.90+0.11A+0.40B+0.41C-0.17AB+
數(shù)值模型方差分析結(jié)果見表3。P值作為檢測影響因素顯著性的一個指標,P值越小,表明對應(yīng)的因變量影響越大。**表示極顯著。
表2 BBD實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 BBD experimental design and results
表3 提取率模型方差分析Tab.3 Variance analysis for extraction rate
模型F值為19.29,P值為0.0004,意味著模型是極顯著的。失擬項的P值為0.23>0.1,說明失擬項不顯著。該回歸模型決定系數(shù)R2=0.961 2,說明該模型能解釋96.12%的數(shù)值,擬合程度較好,實驗誤差較小,因此該回歸模型成立。模型一次項B、C影響是顯著的(P<0.1),互頂項A2、B2、C2影響也是顯著的(P<0.1)。在這種情況下,C2的P值遠遠小于其他互頂項,故C2是考慮提取率的極重要的模型項。其他交互頂項對提取率的影響不顯著,表明這幾個因素無交互作用。在所選的各因素水平范圍內(nèi)比較P值,按照對提取率影響顯著性的大小排列為液料比C>提取時間B>提取溫度A。
利用Design-Expert 8.0.6軟件解析各因素交互影響的響應(yīng)面及等高線,結(jié)果如圖3所示。通過對比,得到三個因素對提取率的影響順序:液料比C>提取時間B>提取溫度A。這與方差分析結(jié)果相符合。綜合考慮和權(quán)衡指標后,對回歸方程進行求解,得到模型最佳解為提取溫度為51℃,提取時間為2.5 h,液料比為16 mL:1 g,模型預(yù)測值提取率Y=4.99%。
在此條件下做5組平行實驗,計算多糖的平均提取率為4.92%,與預(yù)測值的相對誤差為1.4%,實驗值與模型預(yù)測值擬合性良好。
實驗研究證明了爬山虎落葉中含有多糖,采用水-乙醇雙溶劑最大提取率為4.92%。單因素考察了影響多糖浸提率的因素和水平;響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳提取工藝參數(shù):提取溫度51℃,提取時間2.5 h,液料比16 mL:1 g,模型預(yù)測的多糖提取率Y=4.99%;影響多糖提取率的各因素顯著性大小為:液料比>提取時間>提取溫度。無水乙醇對多糖提取物有純化作用,2次醇沉即可達到純度最大33.56%。
圖3 各因素交互影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surfaces and contour lines under interactive influence of various factors