劉學(xué)剛，劉艷彩，吳春平，李景光，趙嶺嶺，張 浩，張振亞

(衡水市第四人民醫(yī)院 1.普外科; 2.病理科， 河北 衡水 053000; 3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 外二科,河北 石家莊 050000)

在中國，結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率和病死率一直居高不下。據(jù)統(tǒng)計，全國每年約有37.6萬人發(fā)病，19.1萬人死亡，嚴(yán)重影響人類健康[1]。所以尋找新的腫瘤標(biāo)志物以及新的治療靶點至關(guān)重要。

作為四跨膜蛋白家族(transmembrane 4 superfamily，TM4SF)成員之一，CD151(白細(xì)胞分化抗原151)在多種腫瘤中呈高表達(dá)，如乳腺癌[2]、前列腺癌[3]及結(jié)直腸癌[4]，能夠促進癌細(xì)胞的增殖、侵襲，并且在血管增生中扮演著重要的角色[5-6]，在腫瘤的進展中發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明，CD151在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，可以作為潛在的標(biāo)志物，然而CD151在結(jié)直腸癌中所發(fā)揮的功能鮮有報道。以此為出發(fā)點，作者接下來將要在結(jié)直腸癌中對CD151的功能展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29及CD151-HT29細(xì)胞(河北中醫(yī)學(xué)院藥理實驗室),慢病毒(漢恒生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑：DEME培養(yǎng)基 (杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶 (上海源葉生物科技有限公司)；BCA蛋白分析試劑盒 (Thermo Fisher公司)；β-actin抗體 (Abcam公司)；Trizol裂解液 (Becton-dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：將人結(jié)直腸癌細(xì)胞系用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至80%匯合度時，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，離心，無菌PBS洗2遍，培養(yǎng)基重懸，重新鋪到新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每1 d換液1次，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 Western blot檢測CD151蛋白：提取蛋白質(zhì)，使用BCA法測蛋白質(zhì)濃度，確定并統(tǒng)一SDS-PAGE凝膠電泳上樣量。取30 μg樣品蛋白加入等量的2×上樣的緩沖溶液，混勻煮沸10 min, 上樣, 80 V恒壓電泳直至溴酚藍(lán)剛從膠中跑出。電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜90 min，0.35 A。經(jīng)封閉液封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育后進行曝光。

1.2.3 實時定量PCR檢測mRNA：提取RNA，將提取出來的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI Gene Bank內(nèi)提供的基因序列, β-catenin引物序列為：上游引物：5′-GCTACTTGTGAGTGAAG-3′，下游引物為:5′-ATGGAACCAGACAGAAAAGC-3′。CD151引物序列為：上游引物：5′-GAGGTCTATGGGTGAGT TCAACGAG-3′，下游引物：5′-AATTCCTCAGGCGT AGTC-3′。按照real-time PCR說明書，配置反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次，72 ℃終延伸2 min。數(shù)據(jù)以2-△△Ct法進行分析。

1.2.4 MTS實驗檢測細(xì)胞增殖：取處于對數(shù)期的HT29和CD151-HT29細(xì)胞，消化離心后，以每孔2×103個細(xì)胞鋪入96孔中，待細(xì)胞貼壁后，分別檢測0，24，48，72和96 h的吸光度值。

1.2.5 平板集落檢測細(xì)胞集落形成：取處于對數(shù)期的HT29和CD151-HT29細(xì)胞，消化離心后，以每孔1×103個細(xì)胞鋪入6孔板中，5 d后對細(xì)胞進行甲醇固定5 min，結(jié)晶紫染色5 min，觀察細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲：取處于對數(shù)期的HT29和CD151-HT29細(xì)胞，以每孔3×105個細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，待72 h后將小室固定于甲醇內(nèi)5 min，結(jié)晶紫染色5 min。置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞穿過Transwell小室數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HT29和CD151-HT29細(xì)胞中CD151表達(dá)情況

CD151-HT29細(xì)胞組中的CD151的 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平較對照組細(xì)胞明顯降低(P<0.05)(圖1)。

A.CD151 mRNA expression of HT29 and CD151-HT29; B.CD151 protenin expression of HT29 and CD151-HT29; C.relative absorbance value of fig B; *P<0.001 compared with normal control group

2.2 HT29和CD151-HT29細(xì)胞的增殖以及平板克隆形成情況

2.2.1 MTS實驗：CD151-HT29細(xì)胞的增殖能力較對照組細(xì)胞明顯減弱(P<0.05)(圖2)。

*P<0.001 compared with control group圖2 HT29和CD151-HT29細(xì)胞的增殖情況Fig 2 Proliferation of HT29 and CD151-HT29 cells

2.2.2 平板集落形成實驗：克隆實驗5 d后，CD151-HT29細(xì)胞數(shù)目較對照組細(xì)胞明顯減少(P<0.05)(圖3)。

A.colony formation of HT29 and CD151-HT29 cells(×4); B.statistical chart of HT29 and CD151-HT29 cells; *P<0.01 compared with control group

2.3 HT29和CD151-HT29細(xì)胞的侵襲情況

將Transwell小室置于顯微鏡下觀察， CD151-HT29組穿過小室膜的細(xì)胞較對照組細(xì)胞明顯減少(P<0.05)(圖4)。

A.invasion activity of HT29 and CD151-HT29 cells(×10); B.statistical chart of HT29 and CD151-HT29 cells;*P<0.001 compared with control group

2.4 HT29和CD151-HT29細(xì)胞中CD151、LRG-1、LGR-5以及β-catenin蛋白表達(dá)情況

CD151-HT29細(xì)胞組中的CD151、LRG-1、LGR-5以及β-catenin蛋白表達(dá)強度較對照組細(xì)胞明顯降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.01 compared with control group圖5 HT29和CD151-HT29細(xì)胞中LRG-1、LGR-5以及β-catenin蛋白表達(dá)情況Fig 5 Expression of LRG-1, LGR-5 and β-catenin in HT29 and CD151-HT29 n=3)

3 討論

CD151是四跨膜蛋白超家族中的一員，是一個蛋白編碼基因，其與遺傳性皮膚病及流感等疾病相關(guān)[7]。此外，CD151還參與了細(xì)胞黏附等過程，可增強癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力，在細(xì)胞的發(fā)育、增殖及運動中發(fā)揮著重要作用[8-10]。并且，CD151能夠促進腎細(xì)胞癌的進展[11]， CD151過表達(dá)在乳腺癌或胃癌患者中是顯著的，CD151過表達(dá)與人類某些實體瘤的較差存活相關(guān)[12]。也有多篇相關(guān)研究通過免疫組化表明，CD151在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，并與預(yù)后相關(guān)，然而關(guān)于CD151在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的功能還未明確。

因此，作者采用了CD151基因穩(wěn)定低表達(dá)的慢病毒(sh-CD151)，感染結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29，通過Western blot技術(shù)以及實時定量熒光PCR技術(shù)，表明感染CD151低表達(dá)病毒后， HT29細(xì)胞的CD151表達(dá)被明顯抑制。緊接著MTS增殖實驗以及平板集落形成實驗結(jié)果顯示，CD151-HT29組細(xì)胞的增殖能力以及克隆形成能力明顯低于對照HT29細(xì)胞組，上述結(jié)果表明抑制CD151的表達(dá)能夠明顯抑制癌細(xì)胞的增殖能力。此外，作者還通過Transwell小室實驗表明，抑制CD151的表達(dá)能夠明顯抑制癌細(xì)胞的侵襲能力。然而關(guān)于CD151是如何對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖以及侵襲產(chǎn)生作用還不清楚。

CD151能夠影響Wnt/β-catenin信號通路中起始蛋白的表達(dá)，并且β-catenin蛋白能夠影響結(jié)直腸癌的增殖、遷移及血管增生等過程[13]，在結(jié)直腸的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。然而在結(jié)直腸癌中，關(guān)于CD151是否能夠調(diào)控β-catenin蛋白的表達(dá)卻未有報道。

作者通過蛋白印跡實驗表明，穩(wěn)定敲低CD151后，Wnt信號通路起始蛋白LRG-1和LGR-5的表達(dá)明顯減弱，此外β-catenin蛋白的表達(dá)也明顯減弱。由此，作者得知，CD151確實可以影響β-catenin蛋白的表達(dá)。

本研究明確了CD151在結(jié)直腸癌中的促癌功能，有助于揭示CD151的促癌分子機制，補充了CD151在結(jié)直腸癌中的相關(guān)背景知識，進一步表明CD151可能是一個有價值的預(yù)后生物標(biāo)志物或?qū)嶓w瘤的潛在治療靶點。為未來結(jié)直腸癌的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。