楊國慧，范珍珠，李 玲，李鐵梅，郭瀟雨，張?zhí)N瑭，王一凡

（1.東北農業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030；2.農業(yè)農村部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030）

樹莓（Rubus idaeusL.），又稱托盤、懸鉤子等，屬于薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（RubusL.）多年生半灌木性小漿果果樹[1]。樹莓可采用實生、根蘗和組織培養(yǎng)等繁殖方法，生產(chǎn)中主要采用根蘗苗和組培苗，育種中常用種子實生繁殖[2]。樹莓種子小、發(fā)芽率低，種子萌發(fā)時間達半年以上，出苗不整齊，影響獲得雜種實生苗[3]。

種子休眠原因一般分為五種：①形態(tài)休眠（Morphological dormancy，MD），是指種子中胚某個部位發(fā)育不完整或不全，如胚芽、胚軸、子葉等；② 生理休眠（Physiological Dormancy，PD），主要由胚內部生理因素造成；③形態(tài)生理休眠（Morphophysiological dormancy，MPD），則是上述兩種因素共同形成；④物理休眠（Physical dormancy，PY），主要是由于種子種皮和外殼柵欄組織細胞阻止種子吸收水和氧氣，使種子難以萌發(fā)；⑤混合型休眠（PY+PD）[4-6]。目前認為，果樹種子屬于混合型休眠居多，種子外部有一層硬實且隔水的種皮或外殼，同時種胚中抑制物導致生理休眠[7-8]。有關樹莓種子休眠原因研究較少，一般認為種皮厚而致密是種子難以萌發(fā)主要原因，種皮和胚乳中的抑制物質也可能影響種子萌發(fā)。Shahzad等研究表明，即使樹莓種子受相同破皮、層積和外源激素處理，其最終發(fā)芽率仍相差較大，認為樹莓種子萌發(fā)存在基因型差異[9]。

為全面了解影響樹莓種子萌發(fā)因素，本研究通過從種子解剖觀察、種皮透氣透水性試驗、種子不同部位（內果皮、種皮、胚和胚乳）中抑制物以及內源激素影響等方面綜合分析樹莓種子休眠原因，旨在為提高樹莓種子萌發(fā)率方法提供理論依據(jù)，加快樹莓雜交育種工作進程。

1 材料與方法

1.1 材料

以夏果型樹莓“大紅樹莓”為試驗材料，于東北農業(yè)大學實驗實習與示范向陽基地農場采集3種不同果實成熟期（青果期、白果期和成熟期）種子。果實成熟期劃分參考文獻[10]方法，其劃分標準為：青果期果實體積小、硬度較大，顏色呈青綠色，與花托緊密結合；白果期果實稍大且顏色呈黃白色；成熟期果實全部著色呈深紅色，與花托分離。

1.2 方法

1.2.1 種子顯微結構觀察

試驗采用3種不同果實成熟期采集的種子，F(xiàn)AA固定液（70%乙醇：福爾馬林：冰醋酸=90∶5∶5）固定，采用常規(guī)石蠟切片法制片，番紅、固綠染色，光學顯微鏡（MoticBA210）下拍照觀察。

1.2.2 破皮對種皮透氣透水性及種子萌發(fā)的影響

破皮對種皮透氣透水性影響：取成熟期種子5 g，于種子背部破皮處理，用于透氣透水性試驗。種皮透水性測定具體方法參考常青山等[11]，種皮透氣性測定：將破皮種子置于廣口瓶中，25℃溫水中浸泡3 d，CO2呼吸分析儀（GXH-3010E1）測定瓶內初次CO2釋放量，然后將瓶子于恒溫箱中（25℃）靜置2 h，再次測定CO2釋放量。公式如下：

式中，C1-初始CO2含量（μmol·mol-1）；C2-t時間后CO2含量；V0-測定溫度下CO2物質的量體積（L·mol-1）；N-種子鮮重（kg）；T-放置時間（h）。

破皮對種子萌發(fā)影響：在4℃冰箱冷藏0、30 d后取出，分別在種子胚根端、胚乳端、種子背部橫切，置于25℃恒溫箱，觀察種子萌發(fā)情況，以未處理種子為對照。

1.2.3 樹莓種子提取物對白菜種子發(fā)芽的影響

采用果實成熟期未經(jīng)冷藏處理和冷藏180 d（4℃）樹莓種子，利用甲醇提取法分別提取內果皮、種皮、胚與胚乳抑制物[12]。首先在培養(yǎng)皿中鋪好濾紙，分別加入樹莓種子各部位甲醇提取物1 mL，然后再播種30粒白菜種子，以蒸餾水為對照（CK），48 h后統(tǒng)計白菜種子發(fā)芽率，測量胚根長度。將種子各部位甲醇提取物按圖1中所示流程分離，獲得7個分離相，用其提取液作白菜種子發(fā)芽試驗，方法同文獻[12]。

1.2.4 種子內源激素含量測定

選用3種不同果實成熟度采集以及不同冷藏（4℃）天數(shù)（30、60和90 d）種子，其中果實成熟期采集和冷藏90 d（4℃）種子分別取3個部位：內果皮、種皮、胚與胚乳。

采用液相色譜法測定IAA、ABA、6-BA、GA3內源激素含量，提取方法參照張占暢等[13]。液相色譜條件：C18色譜柱（5 μm，4 nm×250 nm），柱溫為室溫，流動相是乙腈：甲醇：70%冰乙酸（體積比5∶50∶45），流速為0.8 mL·min-1，進樣量為20 μL，檢測波長為260 nm，采用儀器為高效液相色譜儀，儀器型號為APS-80-16A。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

上述試驗均3次重復，利用Excel 2007和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)作方差分析和多重比較（Duncan法），小寫字母表示P≤0.05差異顯著。

2 結果與分析

2.1 種子顯微結構觀察

樹莓種子解剖結構觀察表明，樹莓種子由內果皮、種皮、胚乳與胚組成。內果皮較厚且表面堅硬，隨種子不斷發(fā)育，內果皮慢慢變薄，到成熟期種子內果皮平均厚度減至133.40 μm；而種皮逐漸增厚，到成熟期種皮厚度增至25.05 μm；胚乳層與種皮緊密結合，隨種子發(fā)育逐漸變??；白果期時兩片子葉分離，到成熟期完全分離（見表1和圖2）。

2.2 破皮對種皮透氣透水性及種子萌發(fā)的影響

破皮和完整種子0～6 h階段吸水量增加趨勢均比較明顯，但破皮與完整種子吸水量相比明顯增多。6～12 h時，破皮種子吸水量不變，完整種子吸水量仍緩慢增加。破皮種子浸泡6 h即達到飽和狀態(tài)，而完整種子則在12 h達到飽和狀態(tài)，可見樹莓種皮對種子吸水率存在抑制作用（見圖3）。

根據(jù)公式計算得出，放于密閉空間內2 h后，完整種子呼吸速率為23.135 mg·kg-1·h-1，刺破種皮處理后種子呼吸速率為57.762 mg·kg-1·h-1。由此可見，破皮種子呼吸速率明顯高于完整種子呼吸速率（見圖4）。成熟期采集未冷藏種子，在胚乳端、胚根端、種子背部橫切，兩周后出苗率分別為13.04%、0.10%、0，對照為未出苗，而冷藏30 d破皮處理種子和對照均未出苗（見圖5）。

2.3 樹莓種子提取物對白菜種子發(fā)芽的影響

果實成熟期采集未冷藏樹莓種子與冷藏180 d種子其各部位甲醇提取物對白菜種子發(fā)芽率及胚根生長均有顯著抑制作用，其中胚與胚乳甲醇提取物抑制作用最為顯著，兩個時期白菜種子發(fā)芽率分別為12.23%和0，胚根長度分別為4.32 mm和0 mm。各部位甲醇提取物抑制作用由強到弱依次為胚與胚乳、種皮、內果皮。兩個不同時期樹莓種子中，胚與胚乳部分甲醇提取物均顯著抑制白菜種子發(fā)芽率及胚根生長。與未冷藏種子相比，冷藏180 d種子中內果皮和種皮部分甲醇提取物對白菜種子發(fā)芽率和胚根長抑制作用變弱，而胚與胚乳部分抑制作用增強，發(fā)芽率為0（見表2）。

表1 不同發(fā)育時期樹莓種子顯微結構觀察Table 1 Observation on the microstructure of raspberry seeds at different developmental stages (μm)

表2 不同冷藏時期樹莓種子提取物對白菜種子發(fā)芽及其胚根長度的影響Table 2 Effects of extracts of raspberry seed in different cold storage periods on the germination and radicle length of cabbage seeds

未冷藏樹莓種子內果皮甲醇提取物7個分離相中，B、D相顯著抑制白菜種子發(fā)芽率和胚根生長，萌芽率和胚根生長均為0，其他相抑制程度強弱依次為F、C、G、E、A相。而冷藏180 d后，A、B、F相抑制作用最明顯。其余依次為G、C、E、D相。通過比較可看出，冷藏180 d后A、F相抑制作用明顯上升，C、D、E、G相抑制作用下降，B相抑制作用不變（見表3、4）。

表3 不同冷藏時期樹莓種子各部位分離相對白菜種子發(fā)芽率的影響Table 3 Effect of separated phase of raspberry seed parts in different cold storage periods on the germination rate of cabbage seed

表4 不同冷藏時期樹莓種子各部位分離相對白菜種子胚根生長的影響Table 4 Effect of the separated phases of raspberry seed parts in different cold storage periods on growth of radicles of cabbage seeds

未冷藏樹莓種子種皮部位甲醇提取物7個分離相中，A、B、F相顯著抑制白菜種子發(fā)芽率和胚根生長，萌芽率和胚根生長均為0。其他相抑制程度強弱依次為C、G、E、D相。而冷藏180 d后，A、B、F相抑制程度最強，其余依次為G、C、E、D相。通過比較可看出，冷藏180 d后，A、B、F相抑制程度無變化，而C、D、E、G相抑制程度降低（見表3、4）。

未冷藏樹莓種子胚與胚乳部位甲醇提取物7個分離相中，G、B顯著抑制白菜種子發(fā)芽率和胚根生長，發(fā)芽率分別為3.33%和9.0%，胚根長分別為3.38和7.90 mm。其他相抑制程度強弱依次為C、E、F、D、A相。而冷藏180 d后，A、B、F相抑制作用最強，其余依次為D、C、E、G相。通過比較可看出，冷藏180 d后，A、B、F相抑制作用明顯增強，C、E、G相抑制作用下降，D相抑制作用無變化（見表3、4）。

2.4 種子內源激素含量測定

樹莓種子中IAA含量在青果期種子中最少，為36.25 μg·g-1，從青果期到冷藏 60 d，呈遞增趨勢，冷藏90 d種子中IAA含量下降，為52.33 μg·g-1（見圖6A）。ABA含量從青果期到白果期降至18.71 μg·g-1，果實成熟期時顯著上升到最大值85.33μg·g-1后，逐漸下降（見圖6B）。青果期到白果期GA3含量逐漸降至最低，為20.79 μg·g-1，此后呈顯著遞增趨勢，于冷藏90 d達最大值，為30.16 μg·g-1（見圖6C）。種子中6-BA含量變化在生長時期呈顯著增加趨勢，青果期含量最低為6.23 μg·g-1，冷藏 90 d后，6-BA 含量達最大值 22.16 μg·g-1（見圖6D）。

如圖7所示，IAA含量最多部位均為種皮部分，種皮中IAA含量隨冷藏天數(shù)增加而增加。果實成熟期時IAA含量最少的部分是胚與胚乳，含量為10.2 μg·g-1，冷藏90 d后，IAA含量最少部位為內果皮，含量11.93 μg·g-1（見圖7A）。果實成熟期種子中ABA含量最高部位為內果皮，含量為40.21μg·g-1，其次是胚與胚乳，種皮最低。冷藏90 d種子中ABA含量最高為胚與胚乳部分，15.76 μg·g-1（見圖7B）。成熟期時GA3含量為種皮最高、內果皮最低，分別為11.56和3.79 μg·g-1。冷藏90 d種子中含量最多部位為胚與胚乳11.23 μg·g-1，含量最少部位為種皮7.31 μg·g-1（見圖7C）。果實成熟期和冷藏90 d樹莓種子中6-BA含量變化趨勢相同，隨冷藏天數(shù)增加，各部位6-BA含量逐漸增多，成熟期胚與胚乳部位6-BA含量為8.13 μg·g-1，冷藏90 d后含量增至9.23 μg·g-1（見圖7D）。通過對比可看出，果實成熟期未冷藏種子內果皮、種皮、胚與胚乳中含量最高為ABA，冷藏90 d后含量最高為IAA。

3 討論

樹莓果實屬于聚合小核果，其種皮主要由子房內壁發(fā)育成的內果皮和珠被發(fā)育成的種皮兩部分組成[14]。本研究解剖構造觀察發(fā)現(xiàn)，從青果期到果實成熟期樹莓種子內果皮雖逐漸變薄，但果實成熟期種子其內果皮占種子比例較大，其厚度約為種皮5倍，且呈“齒輪狀”。利用一定濃度硫酸處理樹莓種子，可提高種子萌發(fā)率，加快萌發(fā)速度[15]。本研究樹莓種子破皮處理后透水透氣性增強，化學和物理方法可破壞種皮堅硬結構，促進種子萌發(fā)。由此可知，內果皮和種皮結構致密，尤其是內果皮較厚，阻礙種胚吸收水分和氧氣，此為影響樹莓種子萌發(fā)的主要因素。

丁言等研究表明，牡丹種子浸提液顯著抑制白菜種子萌發(fā)[16]。由樹莓種子各部分（內果皮、種皮、胚和胚乳）抑制物對白菜種子發(fā)芽率的影響可知，無論是未經(jīng)冷藏種子還是冷藏180 d樹莓種子，胚與胚乳部分甲醇提取物抑制作用最強。在破皮試驗中也發(fā)現(xiàn)，破壞樹莓種子胚乳端后兩周內種子發(fā)芽率達13.04%，且觀察到在胚乳端有脂類物質析出，推測此類物質可能為不飽和脂肪酸。也有研究證明，樹莓種子中含有較多亞油酸、亞麻酸、油酸等不飽和脂肪酸物質，而亞麻酸和亞油酸含量高可能導致種子活力下降[17]。對未冷藏和冷藏180 d樹莓種子甲醇提取物初步分離得到7個分離相分析結果表明，未冷藏樹莓種子中胚與胚乳部分抑制物主要為B、C、G相。根據(jù)楊曉玲等研究結果，C相抑制物質為酸性物質，可能為脫落酸（ABA）類[12]。冷藏180 d的C相提取液對白菜種子抑制作用已降低，說明隨冷藏天數(shù)增加ABA含量逐漸降低，與樹莓種子中激素含量測定結果一致。上述研究表明，胚和胚乳層抑制物也是抑制樹莓種子萌發(fā)重要因素。

植物內源激素在種子萌發(fā)與休眠過程中發(fā)揮重要作用[18]。一般認為，6-BA、GA3對打破種子休眠具有積極調控作用，而ABA促進種子休眠，關于IAA作用目前尚無定論[19]。本研究中隨果實發(fā)育和種子冷藏時間增加，IAA、6-BA、GA3呈增加趨勢，ABA含量果實成熟期達峰值，之后持續(xù)下降。激素對于種子萌發(fā)影響不僅與內源激素絕對含量有關，各激素之間相互平衡也與種子萌發(fā)關系密切，特別是與促進種子萌發(fā)激素和抑制種子發(fā)激素比例有關。本研究中6-BA、IAA、GA3與ABA比值變化規(guī)律相似，青果期到白果期上升，成熟期降至最低，而后逐漸升高，冷藏90 d后IAA/ABA、6-BA/ABA、GA3/ABA值均達到最大，說明激素對種子休眠起綜合調控作用。果實成熟期采集的種子中ABA含量較高，但隨種子冷藏天數(shù)增加，激素含量轉而利于萌發(fā)，激素不再是影響種子萌發(fā)主要因素。

綜上所述，樹莓種子應屬于混合型休眠。其中既有厚而致密的內果皮造成物理性休眠，也有因種子內部，特別是胚和胚乳中抑制物造成生理性休眠。但從樹莓種子不同部位提取物分離相對白菜種子抑制試驗可看出，樹莓種子中抑制物存在部位多、種類多，且隨冷藏時間變化而變化。因此，提高樹莓種子萌發(fā)率，除了破壞種皮結構，還應明確冷藏時間及種子部位（特別是胚和胚乳中抑制物成分）對種子萌發(fā)的影響。