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基于線(xiàn)粒體DNA黑龍江野豬進(jìn)化分析

2020-12-17 08:48王文濤張東杰何鑫淼
關(guān)鍵詞:類(lèi)群核苷酸野豬

王文濤,劉 娣,*,張東杰,何鑫淼,田 明

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,哈爾濱 150086)

豬是最早由人類(lèi)從野生馴化為家養(yǎng)的動(dòng)物,地域和文化差異造成世界豬種遺傳多樣性非常豐富[1],目前認(rèn)為存在2個(gè)以上豬集中馴化區(qū)域[2-3]。野豬馴化成為家豬是長(zhǎng)期自然和人工選擇結(jié)果,從分子遺傳學(xué)角度分析豬起源和進(jìn)化方面認(rèn)為,人類(lèi)需求性選擇影響不同區(qū)域豬種群分化程度,豬品種呈表型和生產(chǎn)性狀差異。韓洪金等研究酪氨酸酶基因外顯子序列發(fā)現(xiàn),中國(guó)地方豬由東亞區(qū)域野豬馴化形成[4],但目前對(duì)于東亞區(qū)域野豬進(jìn)化方面研究較少,因此開(kāi)展黑龍江野豬系統(tǒng)進(jìn)化研究對(duì)闡述東北區(qū)域家豬起源和進(jìn)化歷史具有重要意義。

世界野豬共有5個(gè)屬、8個(gè)種、23個(gè)亞種,中國(guó)野豬有1個(gè)種和7個(gè)亞種,按照地理位置劃分,黑龍江省野豬應(yīng)屬于中國(guó)野豬東北亞種(Sus scrofa ussuricus)。Alves等通過(guò)線(xiàn)粒體DNA研究發(fā)現(xiàn),不同類(lèi)型野豬分別被馴化為歐洲、亞洲地區(qū)家豬[5];Chen等研究歐洲區(qū)域家豬和野豬之間線(xiàn)粒體DNA發(fā)現(xiàn),蘭德瑞斯豬和歐洲野豬酶切圖譜無(wú)差異,說(shuō)明蘭德瑞斯豬可能由歐洲野豬馴化而成[6]。黑龍江省位于我國(guó)東北區(qū)域,北、東部與俄羅斯相鄰,西部與內(nèi)蒙古、南部與吉林省接壤,黑龍江野豬與內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、韓國(guó)野豬之間進(jìn)化關(guān)系一直受研究人員關(guān)注。

目前,在開(kāi)展物種起源、進(jìn)化和馴化方面研究時(shí),常用線(xiàn)粒體DNA檢測(cè)技術(shù),尤其是線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因(Cytochrome b,Cyt b)和線(xiàn)粒體D-loop區(qū)域分析,隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展和大規(guī)模使用,Cyt b基因和線(xiàn)粒體D-loop區(qū)域仍廣泛作為起源進(jìn)化重要標(biāo)記。Cyt b基因具有在動(dòng)植物種群中進(jìn)化速度適中特點(diǎn),適合在野生動(dòng)物群體水平差異檢驗(yàn),Meenakshi等研究發(fā)現(xiàn),豬Cyt b基因有7個(gè)SNP位點(diǎn),揭示Cyt b基因變異對(duì)繁殖性狀影響顯著,認(rèn)為其可作為母豬繁殖性能標(biāo)記[7];Wang等利用Cyt b基因分析山東省地方豬品種與國(guó)外豬品種遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,發(fā)現(xiàn)不同地方豬品種之間遺傳距離較小,可能起源于共同祖先[8]。線(xiàn)粒體D-loop區(qū)為線(xiàn)粒體基因組控制區(qū),位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之間,線(xiàn)粒體D-loop區(qū)一般包括左、右功能區(qū)和中間保守區(qū)3個(gè)區(qū)域,Larso等研究發(fā)現(xiàn),不同區(qū)域家豬和野豬在遺傳方面共同特征較多,從側(cè)面證明不同國(guó)家區(qū)域家豬是由野豬馴化而來(lái);Hongo等研究越南家豬和野豬線(xiàn)粒體DNA發(fā)現(xiàn),亞洲野豬和亞洲家豬共同形成越南本土家豬[9];Kim等對(duì)濟(jì)州豬(韓國(guó))、中國(guó)豬、澳大利亞野豬和歐洲豬等豬種開(kāi)展研究,在最大似然距離基礎(chǔ)上分析其線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列多態(tài)性和不同豬種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,獲得不同豬種起源進(jìn)化關(guān)系[10]。綜合前人研究思路,本研究通過(guò)Cyt b基因和線(xiàn)粒體D-loop區(qū)測(cè)序、發(fā)育分析和單倍型組成分析研究黑龍江野豬系統(tǒng)進(jìn)化路徑具有可行性。

目前,關(guān)于我國(guó)東北地區(qū)野豬起源與進(jìn)化研究報(bào)道較少,東北地區(qū)野豬在全國(guó)野豬進(jìn)化分支地位尚待確定,因此,本研究通過(guò)采集黑龍江地區(qū)野豬樣本,與NCBI提供其他地區(qū)樣本Cyt b基因和線(xiàn)粒體D-loop區(qū)整合,開(kāi)展分子進(jìn)化研究,旨在從線(xiàn)粒體水平檢測(cè)與闡釋黑龍江野豬系統(tǒng)演化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試動(dòng)物

黑龍江野豬樣品23個(gè),來(lái)自黑龍江省小興安嶺地區(qū),采集耳組織樣品,液氮保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所分子遺傳實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試藥劑

DNA Marker DL2000、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、rTaq DNA聚合酶、pMD18-T載體均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取野豬耳組織樣品50~100 mg,使用酚抽提法提取DNA,使用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定和檢測(cè)DNA質(zhì)量,樣品DNA的OD260/280為1.70~1.90,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí),應(yīng)滿(mǎn)足條帶清晰、整齊、無(wú)拖尾,點(diǎn)樣孔附近無(wú)殘留等條件,符合后續(xù)試驗(yàn)要求,樣品DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI上豬Cyt b基因序列(NC_000845)設(shè)計(jì)引物(Forward:5'ATG ACC AAC ATC CGA AAA TCA CAC C 3';Reverse:5'TCA CTT TAA TAG GTT GTT TTC GAT G 3'),預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 137 bp。

參照NCBI上豬線(xiàn)粒體DNA序列(NC_000485.1)設(shè)計(jì)引物(Forward:5'CAA GCA TTC CAT TCG TAT GCA 3';Reverse:5'TGT ACG TTA TGT CCT GTA ACC ATT G 3'),擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镈-loop區(qū)150~591 bp,預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為441 bp。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系:基因組DNA(50 ng·μL-1)1 μL,上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1 μL,rTaq DNA聚合酶(5 U·μL-1)1 μL,dNTPs(10 mmol·L-1)2 μL,10 × PCR Buffer 2 μL,ddH2O 11 μL,共計(jì)20 μL。

PCR反應(yīng)條件為:95℃,5 min;30個(gè)循環(huán):95℃,30 s;退火,30 s;72℃,60 s,循環(huán)結(jié)束;72℃,10 min;16℃,30 min,其中Cyt b基因退火溫度為60℃、線(xiàn)粒體D-loop區(qū)退火溫度為57℃。

1.2.4 克隆測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的片段膠回收,連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒后,送至北京華大公司測(cè)序。

1.2.5 遺傳多樣性分析

將所測(cè)得序列使用DNAMAN軟件作拼接和人工比對(duì),應(yīng)用MEGA 7.0軟件比對(duì)整理后序列,并生成.meg格式文件。使用DNASP 5.10打開(kāi).meg格式文件,統(tǒng)計(jì)分析該比對(duì)序列SNP位點(diǎn)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、保守區(qū)間等。

1.2.6 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

自GenBank下載16條野豬Cyt b基因序列、457個(gè)已注釋線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列(D-loop數(shù)據(jù)集:PopSet:735861597, 1002342824, 1408588029,526162927),結(jié)合實(shí)驗(yàn)室獲得黑龍江野豬序列,17條Cyt b基因用于構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù),480條線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列用于單倍型鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。

單倍型鑒定采用DNASTAR lasergene11的Seq-Man Pro分離,SNP保留依據(jù)為最小等位基因頻率(Minor allele frequency,MAF)>0.05,所有序列均采用Mega-X的Clustalw作比對(duì),采用鄰接法建立進(jìn)化關(guān)系,使用500次重復(fù)的bootstrap分析評(píng)估每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)支持。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑龍江野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.1.1 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

以黑龍江野豬線(xiàn)粒體DNA為模板,獲得黑龍江野豬Cyt b基因條帶,PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1,與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符。

圖1 黑龍江野豬Cyt b基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the Cyt b gene in Heilongjiang wild boar

獲得23條黑龍江野豬Cyt b基因序列,23條Cyt b基因全序列長(zhǎng)度均為1 140 bp,見(jiàn)圖2,其中A、T、C、G含量分別為30.2%、26.9%、29.4%和13.5%,平均A+T含量57.1%,平均C+G含量42.9%,A+T含量略高于C+G含量,未出現(xiàn)明顯偏差。

黑龍江野豬23條Cyt b基因序列共存在2個(gè)變異位點(diǎn),全部為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony informative sites),分別位于693 bp和1 045 bp處,無(wú)單一變異位點(diǎn)(Singleton variable sites)。使用Dna SP 5.1軟件分析發(fā)現(xiàn),黑龍江野豬23條Cyt b序列共檢測(cè)出3種單倍型,單倍型多樣性(Hd)為0.605,核苷酸多樣性(π)為0.00067,平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.69203;利用Tajima's D和Fu's Fs檢驗(yàn)得到中性檢測(cè)結(jié)果表明,黑龍江野豬Tajima's D和Fu's Fs值均呈正值,分別為0.64237和0.90198,且差異不顯著(P>0.05),表明黑龍江野豬群體符合中性進(jìn)化假說(shuō),種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài)。

2.1.2 黑龍江野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集整理16條野豬Cyt b基因序列,其中9條為歐洲、亞洲和非洲野豬序列,7條為中國(guó)不同地區(qū)野豬序列,見(jiàn)表1。

圖2 黑龍江野豬Cyt b基因完整編碼區(qū)序列區(qū)Fig.2 Complete sequence region of Cyt b gene in Heilongjiang wild boar

表1 野豬類(lèi)群具體情況Table 1 Specific situation of wild boar group

構(gòu)建不同野豬群體Cytb基因分子進(jìn)化樹(shù),見(jiàn)圖3,結(jié)果表明歐洲和非洲野豬聚在一個(gè)分支,而亞洲野豬聚在另一個(gè)分支,彼此間親緣關(guān)系符合地理分布特征。

2.2 黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 PCR擴(kuò)增與測(cè)定

以黑龍江野豬線(xiàn)粒體DNA為模板,獲得黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop高變區(qū)(150~591 bp)條帶,PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4,與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符。

成功獲得23條黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop高變區(qū)基因序列,其中A、T、C、G含量分別為28.7%、30.0%、25.5%和15.8%,平均A+T含量58.7%,平均C+G含量41.3%,A+T含量略高于C+G,但未出現(xiàn)明顯偏差,序列信息見(jiàn)圖5。

圖3 基于不同野豬群體Cyt b基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Cyt b gene sequence in different wild boar

圖4 黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of the mtDNA D-loop in Heilongjiang wild boar

黑龍江野豬23條D-loop序列共存在4個(gè)變異位點(diǎn),分別位于280 bp、388 bp、453 bp和561 bp處,全部為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)使用Dna SP 5.1軟件分析發(fā)現(xiàn),黑龍江野豬23條D-loop序列共檢測(cè)出3種單倍型,單倍型多樣性(Hd)為0.755,核苷酸多樣性(π)為0.00377,平均核苷酸差異數(shù)(K)為1.668;利用Tajima's D和Fu's Fs檢驗(yàn)得到中性檢測(cè)結(jié)果表明,黑龍江野豬Tajima's D和Fu's Fs值均呈正值,分別為1.493261和2.096753,且差異顯著(P<0.05),表明黑龍江野豬群體符合中性進(jìn)化假說(shuō),種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài)。

圖5 黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop高變區(qū)序列Fig.5 Sequence of hypervariable region in mitochondrial D-loop of Heilongjiang wild boar

2.2 東北亞地區(qū)野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化分析

為探討東北亞地區(qū)野豬種群分化,首先通過(guò)整合NCBI的Popset子庫(kù)中包括內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、韓國(guó)兩個(gè)野豬子數(shù)據(jù)集(popset735861597、popset1002342824),采用鄰接法構(gòu)建基于D-loop區(qū)核苷酸序列鄰接法分子進(jìn)化樹(shù),東北亞地區(qū)野豬群體線(xiàn)粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見(jiàn)圖6。

由圖6可見(jiàn),東北亞地區(qū)野豬主要分3個(gè)類(lèi)群,其中內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林省野豬分為兩個(gè)主要類(lèi)群,一支由黑龍江和內(nèi)蒙古野豬構(gòu)成,另一支由黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古野豬組成,第三支由遼寧省和韓國(guó)野豬組成,說(shuō)明東北亞地區(qū)野豬親緣關(guān)系符合地理分布,但存在地區(qū)差異。

2.3 野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)單倍型鑒定

為進(jìn)一步探索黑龍江野豬起源與進(jìn)化,整合來(lái)自NCBI已注釋西亞野豬、歐洲野豬、東南亞野豬以及中國(guó)其他地區(qū)野豬序列,構(gòu)建包括480個(gè)樣本的歐亞野豬D-loop區(qū)序列集,并以猯和疣豬為兩級(jí)進(jìn)化外類(lèi)群,通過(guò)SeqMan Pro過(guò)濾掉MAF小于0.05位點(diǎn),獲得27個(gè)有效SNPs,其中包括19個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和8個(gè)單一變異位點(diǎn),最大簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為452:C/T,根據(jù)外類(lèi)群提供信息,T為后天突變,見(jiàn)表2,共組成21個(gè)單倍型,歐亞野豬和外類(lèi)群D-loop單倍型序列比對(duì)與進(jìn)化見(jiàn)圖7。

由圖7可見(jiàn),所有野豬單倍型可分成兩個(gè)類(lèi)群:類(lèi)群I和類(lèi)群II,類(lèi)群I主要包括單倍型Hap 1、Hap 2、Hap 4、Hap 8、Hap 9、Hap 11、Hap 13、Hap 14和Hap 18,類(lèi)群B則包含Hap 3、Hap 5、Hap 6、Hap 7、Hap 10、Hap 12、Hap 15、Hap 16和Hap 17。在類(lèi)群I中,除單倍型4,其余單倍型擁有外類(lèi)群代表24T和49C。黑龍江野豬包括3種單倍型,分別為Hap 7、Hap 9和Hap 15,其中Hap 9和Hap 15處于類(lèi)群I,Hap 7處于類(lèi)群II。

圖6 東北亞地區(qū)野豬群體線(xiàn)粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.6 Phylogenetic relationship derived from mitochondrial D-loop region sequences of wild boar population in Northeast Asia

表2 歐亞野豬mtDNA D-loop突變位點(diǎn)分析Table 2 Analysis of mtDNA D-loop mutation loci in Eur-asian wild boar

圖7 歐亞野豬和外類(lèi)群D-loop單倍型序列比對(duì)與進(jìn)化Fig.7 D-loop haplotype sequence alignment and evolutionary of Eur-asian wild boars and outgroups

2.4 東北地區(qū)野豬單倍型組成鑒定與進(jìn)化分析

基于歐亞野豬D-loop區(qū)序列單倍型情況,對(duì)包括中國(guó)黑龍江野豬、內(nèi)蒙古野豬、吉林野豬、遼寧野豬和韓國(guó)野豬在內(nèi)東北亞地區(qū)56個(gè)野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)高變序列作單倍型歸類(lèi),發(fā)現(xiàn)東北亞地區(qū)野豬種群共涉及5個(gè)單倍型,分為兩個(gè)類(lèi)群,類(lèi)群I組包括Hap 3、Hap 7、Hap 9和Hap 15,類(lèi)群II組僅包括Hap 1,采用鄰接法重新構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù),每個(gè)單倍型所包含不同地區(qū)野豬群體見(jiàn)圖8。

圖8 東北亞地區(qū)野豬D-loop單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.8 Phylogenetic relationship derived from D-loop haplotype sequences of wild boar population in Northeast Asia

由圖8可見(jiàn),黑龍江野豬具有3個(gè)單倍型,分別為Hap 7、Hap 9和Hap 15,同時(shí)具有24C、24T和49T,內(nèi)蒙古野豬具有2種單倍型,分別為Hap 3和Hap 7,具有24C和49T,遼寧和韓國(guó)野豬僅一種單倍型,為Hap 1,具有與外類(lèi)群一致24T和49C。

3 討 論

3.1 線(xiàn)粒體DNA

線(xiàn)粒體DNA呈母系遺傳特性,同時(shí)具有相對(duì)穩(wěn)定、背景清晰、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子質(zhì)量較小、數(shù)據(jù)來(lái)源廣泛、數(shù)量眾多等特點(diǎn),為研究生物母系起源重要標(biāo)記基因,同時(shí)試驗(yàn)材料要求相對(duì)低、獲得結(jié)果清晰,在群體遺傳學(xué)、基因組學(xué)、系統(tǒng)與進(jìn)化生物學(xué)等方面研究應(yīng)用廣泛[11-12],但因其無(wú)法反應(yīng)父系遺傳情況,不遵守孟德?tīng)栠z傳定律,具有一定局限性,豬線(xiàn)粒體DNA編碼Cyt b基因等37個(gè)基因,而D-loop區(qū)為非編碼區(qū),主要作用為調(diào)控線(xiàn)粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄。本研究利用Cyt b基因和D-loop區(qū)開(kāi)展黑龍江野豬系統(tǒng)進(jìn)化研究,從母系遺傳角度獲得其規(guī)律,但同樣受線(xiàn)粒體DNA局限性制約,需深入研究。

3.2 野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化

現(xiàn)代野豬在全球各地皆有分布,研究人員利用線(xiàn)粒體DNA檢測(cè)技術(shù),在野豬和家豬起源方面開(kāi)展大量研究,認(rèn)為不同地區(qū)家豬間在線(xiàn)粒體DNA上遺傳差異較大,相同地區(qū)家豬和野豬間共同遺傳特征較多,證明不同地區(qū)家豬由當(dāng)?shù)匾柏i馴化而來(lái)。本課題組前期在對(duì)民豬和大白豬Cyt b基因作遺傳多樣性研究時(shí)發(fā)現(xiàn),民豬60條Cyt b基因序列共存在5個(gè)變異位點(diǎn)、5種單倍型,單倍型多樣性為0.638,核苷酸多樣性為0.0011,平均核苷酸差異數(shù)為1.11356,中性檢測(cè)結(jié)果表明,民豬群體符合中性進(jìn)化假說(shuō),種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài);大白豬Cyt b基因序列共存在14個(gè)變異位點(diǎn)、4種單倍型,單倍型多樣性為0.581,核苷酸多樣性為0.00599,平均核苷酸差異數(shù)為6.05419,中性檢測(cè)結(jié)果表明,大白豬群體不符合中性進(jìn)化假說(shuō),種群經(jīng)過(guò)擴(kuò)張。本試驗(yàn)在對(duì)黑龍江野豬Cyt b基因研究中同樣通過(guò)單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)分析其遺傳多樣性,與民豬和大白豬群體比較發(fā)現(xiàn),所采集黑龍江野豬Cyt b基因群體遺傳多樣性相對(duì)貧乏,其核苷酸多樣性遠(yuǎn)低于民豬和大白豬,與野生狀態(tài)下黑龍江野豬不同血統(tǒng)個(gè)體交流受限有關(guān),大白豬核苷酸多樣性最高,可能與商品化養(yǎng)殖為避免近交而不斷引入外緣血統(tǒng)或與其他豬種雜交改良有關(guān),利用Tajima's D和Fu's Fs檢驗(yàn)得到中性檢測(cè)結(jié)果表明黑龍江野豬和民豬均符合中性進(jìn)化假說(shuō),種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài),而大白豬群體不符合中性進(jìn)化假說(shuō),種群經(jīng)歷擴(kuò)張,所得結(jié)果與3個(gè)種群實(shí)際情況相符,黑龍江野豬長(zhǎng)期處于自然繁衍狀態(tài),民豬市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力低于進(jìn)口商品豬種,近年一直處于保種狀態(tài),未經(jīng)歷快速擴(kuò)群,處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài),而大白豬則是目前世界范圍內(nèi)大規(guī)模養(yǎng)殖品種;系統(tǒng)進(jìn)化分析表明歐洲和非洲野豬聚為一類(lèi),而亞洲野豬聚為另一類(lèi),彼此間親緣關(guān)系符合地理分布特征。

3.3 野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化

張怡研究發(fā)現(xiàn)野豬種群遺傳結(jié)構(gòu),有27個(gè)單倍型為東亞野豬線(xiàn)粒體DNA D-loop區(qū)序列獨(dú)有,東亞野豬遺傳多樣性顯著高于歐洲野豬,認(rèn)為東亞野豬由12個(gè)獨(dú)立分支構(gòu)成,朝鮮野豬和韓國(guó)野豬分散在3個(gè)亞支中,東亞野豬在不同地理區(qū)域經(jīng)歷不同種群歷史[13]。本研究針對(duì)23頭黑龍江野豬樣品,展開(kāi)線(xiàn)粒體D-loop高變區(qū)150~591 bp測(cè)序分析,所構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明,黑龍江野豬和吉林野豬、內(nèi)蒙古野豬親緣關(guān)系較近,與遼寧野豬和韓國(guó)野豬相對(duì)較遠(yuǎn),符合地理分布特征,與黑龍江野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析一致,也與張冬杰等對(duì)黑龍江野豬分子進(jìn)化分析結(jié)果相同[14]。

在世界家豬進(jìn)化領(lǐng)域,部分研究人員認(rèn)同傳統(tǒng)二元論觀(guān)點(diǎn),即現(xiàn)代家豬有歐亞兩大母系起源,因此野豬也被稱(chēng)為歐亞野豬[15]。野豬根據(jù)地理和形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)則可區(qū)分為4個(gè)“亞種群”,分別為歐洲亞群,包括歐洲野豬、薩丁島野豬、北非野豬、中東野豬、高加索野豬和里海野豬;印度亞群,包括印度野豬和斯里蘭卡野豬;遠(yuǎn)東亞群,包括西伯利亞野豬和烏蘇里野豬、日本的日本野豬和琉球野豬、中國(guó)臺(tái)灣野豬、華南野豬和高麗野豬;印尼亞群,包括印尼野豬,目前已記錄野豬有20個(gè)亞種,黑龍江省內(nèi)野豬,按地理位置分應(yīng)屬于遠(yuǎn)東亞群。倪攀研究歐亞野豬線(xiàn)粒體DNA發(fā)現(xiàn),東北野豬出現(xiàn)在歐洲家豬和野豬分支,部分歐洲家豬出現(xiàn)在亞洲分支,說(shuō)明存在母系滲入現(xiàn)象[16];李崇奇等研究中國(guó)野豬線(xiàn)粒體DNA發(fā)現(xiàn),中國(guó)華南區(qū)域野豬通過(guò)自然遷徙或人口流動(dòng),由華南地區(qū)向北部區(qū)域移動(dòng),到達(dá)中國(guó)東北區(qū)域形成東北區(qū)域野豬[17];徐秋良等在對(duì)淮南豬、東北野豬單倍型Network網(wǎng)絡(luò)研究中發(fā)現(xiàn),東北野豬雖與淮南豬擁有部分共同單倍型,但與國(guó)外豬種親緣關(guān)系較近[18];楊國(guó)偉等在東北野豬線(xiàn)粒體DNA研究中發(fā)現(xiàn),東北區(qū)域野豬可能從歐洲方向遷移而來(lái)[19]。因黑龍江省與俄羅斯接壤有關(guān),其地理區(qū)域橫跨歐亞大陸,部分歐洲野豬參與東北區(qū)域野豬形成。

3.4 黑龍江野豬單倍型進(jìn)化分析

本研究依據(jù)線(xiàn)粒體D-loop高變區(qū)單倍型篩選,歐亞野豬主要有21種單倍型,根據(jù)圖6可看出,外類(lèi)群代表性SNP為24T和49C,由此類(lèi)群I應(yīng)為最古老野豬種群,Hap9和Hap10則為24C和49C,屬于向類(lèi)群II過(guò)渡的代表性單倍型,類(lèi)群II為后續(xù)演化野豬種群,該類(lèi)群可能為第二輪進(jìn)化擴(kuò)散結(jié)果,為歐亞野豬馴化起源提供理論依據(jù)。由單倍型組成分析可知,東北亞地區(qū)野豬共存在5種線(xiàn)粒體D-loop單倍型,根據(jù)圖7單倍型分子進(jìn)化關(guān)系,內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林野豬屬于類(lèi)群II,而遼寧省和韓國(guó)野豬則屬于類(lèi)群I,黑龍江野豬3種單倍型Hap 7、Hap 9和Hap 15中,具有24C、24T和49T,內(nèi)蒙古野豬2種單倍型Hap 3和Hap 7中,具有相同24C和49T,遼寧野豬和韓國(guó)野豬唯一單倍型Hap 1,D-loop區(qū)在此處為24T和49C,與外類(lèi)群猯和疣豬一致,說(shuō)明遼東半島地區(qū)野豬可能為最古老野豬進(jìn)化分支之一;由于樣本收集有限,本研究及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)遼寧野豬、吉林野豬、黑龍江野豬和內(nèi)蒙古野豬線(xiàn)粒體DNA序列中,并未發(fā)現(xiàn)過(guò)渡單倍型Hap9和Hap10,說(shuō)明吉林野豬、黑龍江野豬和內(nèi)蒙古野豬并非從遼東半島演化而來(lái),可能從另外一條遷徙路線(xiàn)形成當(dāng)?shù)匾柏i,在吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古等地發(fā)生分化,而黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)單倍型種類(lèi)最多(3種),包括內(nèi)蒙古野豬和吉林野豬所有單倍型,說(shuō)明黑龍江地區(qū)可能為中國(guó)東北部野豬分化中心之一,研究結(jié)果為東北亞地區(qū)野豬起源與進(jìn)化提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

①獲得黑龍江野豬Cyt b基因序列,其遺傳多樣性相對(duì)較低;分子進(jìn)化樹(shù)顯示不同地區(qū)野豬親緣關(guān)系遠(yuǎn)近符合地理分布特征,與其線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列進(jìn)化分析結(jié)果一致。

②黑龍江野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)序列單倍型系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,黑龍江野豬單倍型種類(lèi)最多(3種),包括內(nèi)蒙古野豬和吉林野豬所有單倍型,黑龍江地區(qū)可能是野豬分化中心之一。

本研究雖整合大量來(lái)自NCBI野豬線(xiàn)粒體D-loop區(qū)數(shù)據(jù),但仍難以保證野豬樣本覆蓋度,線(xiàn)粒體DNA屬于母系遺傳的鑒定手段,后期需開(kāi)展大樣本采集與全基因組測(cè)序,揭示東北亞地區(qū)野豬真正進(jìn)化途徑。

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