周 菲

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱 150086）

向日葵（Helianthus annuusL.）是重要油料和經(jīng)濟(jì)作物[1]。我國向日葵產(chǎn)區(qū)主要分布在東北、西北和華北，冷涼氣候條件下生產(chǎn)的葵花籽一般油酸含量相對(duì)較低，因此，提高向日葵種子油酸含量是我國向日葵遺傳改良重要目標(biāo)。

植物脂肪酸合成代謝通路主要包含脂肪酸脫飽和酶（FAD）、乙酰CoA羧化酶（ACCase）及脂肪酸合酶復(fù)合體（FAS）等。近年來，關(guān)于脂肪酸含量相關(guān)酶基因研究越來越多。至今在大豆中已分離得到脂肪酸合成酶相關(guān)基因包括ACC、FatB、KASⅠ、KASⅡ、KASⅢ、SACPD等[2]。將大豆中GmACP基因沉默后，大豆根中總脂肪酸含量降低22%[3]。將高山被孢霉（Mortierella alpina）中Δ6脫飽和酶的同工酶基因Δ6II轉(zhuǎn)化到米曲菌（Aspergillus oryzae）中表達(dá)，導(dǎo)致γ-亞麻酸（GLA）占總脂肪酸37%，而在對(duì)照米曲菌（Aspergillus oryzae）中未檢測到γ-亞麻酸[4]。將玻璃苣種子中分離的Δ6-脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)化到煙草中，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片脂質(zhì)分析表明，γ-亞麻酸（GLA）和十八碳四烯酸（C18∶4 Δ6,9,12,15）分別積累到總脂肪酸含量13.2%和9.6%[5]。將擬南芥中Δ15脂肪酸去飽和酶轉(zhuǎn)化到大豆，其α-亞麻酸（ALA）含量顯著升高，而同時(shí)具有玻璃苣中Δ6-脂肪酸去飽和酶和擬南芥中Δ15脂肪酸去飽和酶兩種去飽和酶的轉(zhuǎn)基因大豆，其十八碳四烯酸（STA）相對(duì)含量明顯提高，ω-3類脂肪酸相對(duì)含量達(dá)到60%以上[6]。在亞麻中通過體內(nèi)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LuLACS8A和LuDGAT2-3共表達(dá)催化亞麻酸在三酰甘油（TAG）中富集[7]。研究發(fā)現(xiàn)植物中轉(zhuǎn)錄因子對(duì)油脂和脂肪酸合成也具有重要調(diào)控作用，這些轉(zhuǎn)錄因子主要包括AP2家族WRI1、B3家族FUS3、DOF家族DOF、HAP3/CBP家族LEC1和CHD3家族PKL等，利用代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮調(diào)控脂肪酸功能[8]。

油酸（18∶1）第9位與第10位碳原子間含一個(gè)雙鍵因此成為單不飽和脂肪酸，第12位碳原子脫飽和后形成亞油酸（18∶2）[9]。目前向日葵與油酸含量相關(guān)基因研究較少，Δ12脂肪酸脫氫酶基因位于油酸合成通路下游，控制油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸，是控制種子油酸含量關(guān)鍵基因[10]。油料作物如大豆、玉米、油菜、花生種子中，通過RNA干擾等技術(shù)抑制FAD2基因表達(dá)抑制油酸合成亞油酸，顯著提高種子油酸含量[11]。FAB2（Stearoyl-ACP Desaturase 2）編碼Δ9硬脂酰-ACP脫飽和酶，是植物體內(nèi)調(diào)控油酸合成上游基因，在18碳脂肪酸長鏈第9和第10個(gè)碳原子之間插入一個(gè)雙鍵，使硬脂酰-ACP脫氫生成油酰ACP，油酰-ACP轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后形成油酸，該過程直接影響油酸含量。FAB2在大部分高等植物不同組織部位中具有表達(dá)特異性，在發(fā)育種子中表達(dá)量最高[12]。FAB2是脂肪酸合成過程中飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成不飽和脂肪酸關(guān)鍵分支點(diǎn)，是不飽和脂肪酸合成中必不可少的重要酶，F(xiàn)AB2可能是除FAD2外控制油酸含量另一個(gè)關(guān)鍵基因[9]，此外，F(xiàn)AB2還參與植物膜脂質(zhì)中不飽和脂肪酸生物合成，關(guān)系到細(xì)胞膜流動(dòng)性與耐受性，具有抗非生物脅迫等重要功能[13]。但目前關(guān)于向日葵FAB2基因研究未見報(bào)道，其編碼蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及功能尚不明確。

向日葵脂肪酸代謝關(guān)鍵酶基因克隆和表達(dá)模式分析是基因功能研究重要前提，可為向日葵脂肪酸合成分子機(jī)理解析提供科學(xué)依據(jù)。本課題組前期利用高低油酸向日葵種子轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，在脂肪酸代謝通路差異表達(dá)基因中挖掘出可能影響油酸含量的候選基因硬脂酰-ACP脫氫酶基因HaFAB2，以此為基礎(chǔ)，本研究克隆向日葵Ha-FAB2基因，并作生物信息學(xué)分析，結(jié)合高低油酸向日葵種子中油酸積累變化趨勢(shì)，分析HaFAB2基因在不同發(fā)育時(shí)期種子及其他組織部位表達(dá)模式，為該基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”和低油酸保持系“86-1”于2019年種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所試驗(yàn)基地。于同一時(shí)段對(duì)當(dāng)日開花植株掛牌，標(biāo)明開花日期，從開花7 d起，每5 d取5個(gè)花盤，取至開花后37 d，取花盤最外3圈種子，一部分樣品風(fēng)干后測定油酸含量；另一部分液氮速凍后凍存于-80℃冰箱，用于基因克隆和熒光定量PCR分析，基因克隆利用“86-1”開花7 d種子為試驗(yàn)材料。

1.1.2 菌株與載體

克隆載體pMD18-T（TaKaRa），大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（博凌科為）。

1.1.3 主要試劑

所用試劑包括DNA marker DL2000（東盛）、2×KOD PCR MasterMix（艾德萊）、2×Taq PCR Master-Mix（艾德萊）、gel-red染料（莫納）、氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒（天根）、無水乙醇、β巰基乙醇、50×TAE。

1.1.4 培養(yǎng)基配制

液體LB培養(yǎng)基：稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl，溶解于1 L水中。若配制固體LB培養(yǎng)基每升再加12 g瓊脂粉；IPTG溶液（24 mg·mL-1）：稱取0.24 g IPTG，溶解于10 mL去離子水，完全溶解后過濾并滅菌；X-Gal溶液（20 mg·mL-1）：稱取0.1 g X-Gal，溶解于1 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，最后加DMF定容至5 mL。

1.2 方法

1.2.1 種子RNA提取及cDNA第一條鏈合成

利用植物總RNA提取試劑盒（天根）提取向日葵種子總RNA，取0.5 μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第一條鏈。

1.2.2 HaFAB2基因克隆

根據(jù)已公布向日葵基因組數(shù)據(jù)庫信息，設(shè)計(jì)向日葵HaFAB2基因克隆引物，引物序列為F：AGAACAACATCAACAATGGCGATTC，R：AGCAC TACACGAAAGAAACGACAAT，使用高保真酶（艾德萊）擴(kuò)增HaFAB2基因開放閱讀框（ORF）序列，PCR總反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，Primer各1 μL，2×KOD PCR MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃3 min，94℃30s，58℃30 s，72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根）回收目的條帶，并克隆至pMD18-T載體（TaKaRa），挑取陽性克隆，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證送吉林省庫美生物有限公司測序。

1.2.3 基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN比對(duì)克隆基因序列和NCBI公布向日葵基因序列。在NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫中作序列同源性比對(duì)和相似性搜索。MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ExPASy系統(tǒng)下蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測工具Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和原子組成等參數(shù)。利用SOPMA在線程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Protscale在線軟件（http://web.expasy.org/protscale/）分析基因氨基酸序列親/疏水性。

1.2.4 種子油酸含量檢測

向日葵種子油酸含量委托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所測定，采用氣相色譜法，儀器為Agilent7890A氣相色譜儀。利用SPSS 13.0軟件分析種子發(fā)育不同時(shí)期油酸含量變化差異顯著性。

1.2.5 熒光定量PCR分析

采用 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）試劑，Roche LightCycler 480II熒光定量PCR儀，以向日葵β-actin基因（AF282624）為內(nèi)參基因，Real-time PCR總反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1.2 μL， SYBR Green 10 μL， Primer 各 0.6 μL，ddH2O 7.6 μL。Real-time PCR 反應(yīng)程序如下：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，68℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)，待PCR反應(yīng)結(jié)束后分析溶解曲線，采用2-ΔΔCt法分析目標(biāo)基因表達(dá)量。內(nèi)參基因β-actin引物為F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCAGCTTCCATTCCAATCA，HaFAB2熒光定量引物為 F：CTGGTCAAACAGTCAACATATGGGT，R：CA GCGGTTATGGTGAGGT。利用SPSS 13.0軟件分析基因在“L-1-OL-1”和“86-1”種子中表達(dá)量差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵HaFAB2基因克隆

將提取的“86-1”開花7 d種子總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增HaFAB2開放閱讀框（ORF）序列，PCR結(jié)果顯示有符合目的片段長度的單一條帶（見圖1）。將膠回收后目的片段與T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液PCR檢測結(jié)果表明擴(kuò)增出陽性條帶符合目的片段長度，將菌液送至公司測序，比對(duì)結(jié)果表明序列正確。向日葵Ha-FAB2基因ORF核苷酸序列長度為1 191 bp，編碼396個(gè)氨基酸，通過比較克隆的HaFAB2和NCBI公布向日葵FAB2（LOC110878160）序列發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列相似度為99.16%（見圖2）。

圖1 向日葵HaFAB2基因PCR電泳結(jié)果Fig.1 PCR electrophoresis result of sunflower HaFAB2 genes

圖2 克隆HaFAB2與公布向日葵FAB2核苷酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison of nucleotide sequences of HaFAB2 cloned with FAB2 published in sunflower

2.2 HaFAB2基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 向日葵HaFAB2編碼蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測

ExPASy軟件預(yù)測結(jié)果表明，HaFAB2基因編碼蛋白原子總數(shù)6 307個(gè)，分子式C2014H3131N551O594S17，蛋白分子質(zhì)量45.11 ku，等電點(diǎn)理論值5.99，預(yù)測該蛋白為酸性蛋白，HaFAB2編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成見表1。

2.2.2 向日葵HaFAB2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

為分析向日葵HaFAB2基因進(jìn)化關(guān)系，將其與擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）、大豆（Glycine maxL.）、異果菊（Dimorphotheca sinuataDC.）、煙草（Nicotiana tabacumL.）和薇甘菊（Mikania micranthaKunth）等物種FAB2氨基酸序列作系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建與分析（見圖3A）。

上述結(jié)果可知，向日葵HaFAB2與薇甘菊（Mikania micranthaKunth）FAB2聚在同一分支上，進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性高達(dá)94%，可能是由于向日葵和薇甘菊同屬菊科，具有物種同源性。將NCBI上檢索到向日葵FAB家族3個(gè)成員HaFAB1（CAC80359.1）、HaFAB2（XP_021982111.1）、HaFAB3（KAF5783066.1）與擬南芥硬脂酰-ACP脫飽和酶（SAD）家族7個(gè)成員AtSSI2（At2g43710）、AtSAD1（At5g16240）、AtSAD2（At3g02610）、AtSAD3（At5g 16230）、AtSAD4（At3g02620）、AtSAD5（At3g02630）、AtSAD6（At1g43800）以及蓖麻RcSAD1（NP_00131 0659.1）作進(jìn)化關(guān)系分析（見圖3B）。其中，AtSSI2和RcSAD1對(duì)18∶0-ACP具有底物選擇性，催化18∶0-ACP生成18∶1-ACP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HaFAB1、HaFAB2、HaFAB3序列相似性較高，并與擬南芥AtSSI2和蓖麻RcSAD1聚在同一個(gè)分支上，其中HaFAB2與AtSSI2、RcSAD1序列相似性分別高達(dá)80.55%和84.60%，表明親緣關(guān)系較近。

表1 向日葵HaFAB2編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of protein encoded by HaFAB2 in sunflower

圖3 向日葵HaFAB2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HaFAB2 gene in sunflower

2.2.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過使用SOPMA在線軟件預(yù)測分析HaFAB2編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)具有53.54%α螺旋，33.84%無規(guī)則卷曲，7.58%延伸鏈，5.05%β轉(zhuǎn)角。預(yù)測結(jié)果表明，HaFAB2編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋（見圖4）。

圖4 向日葵HaFAB2編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of protein encoded by HaFAB2 in sunflower

2.2.4 蛋白質(zhì)親疏水性分析

蛋白質(zhì)親疏水性一定程度上決定蛋白折疊方式，是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)因素之一，在蛋白特定功能上發(fā)揮重要作用。使用ProtScale分析HaFAB2編碼蛋白氨基酸序列親疏水性。＞0部分高于50%為疏水性蛋白，而＜0部分高于50%為親水性蛋白，可知HaFAB2編碼蛋白為親水性蛋白（見圖5）。

圖5 向日葵HaFAB2編碼蛋白質(zhì)親/疏水性分析Fig.5 Hydrophilic/hydrophobic analysis of protein encoded by HaFAB2 in sunflower

2.3 HaFAB2基因表達(dá)分析

測定向日葵種子不同發(fā)育時(shí)期油酸含量，高、低油酸含量的兩份向日葵材料在種子發(fā)育過程中油酸積累變化趨勢(shì)一致，但稍有不同，在向日葵種子發(fā)育初期至中期（開花后7 d到開花后22 d），隨發(fā)育時(shí)間增加，油酸含量均迅速增長，“L-1-OL-1”在開花后22 d油酸含量有小幅增長，開花后37 d油酸含量達(dá)最高值。而“86-1”在22DAF油酸含量達(dá)最高，之后油酸含量下降，開花后27 d趨于穩(wěn)定（見圖6A）。

通過qRT-PCR檢測向日葵HaFAB2基因在高低油酸向日葵種子不同發(fā)育時(shí)期以及“L-1-OL-1”在開花后7 d根、莖、葉、管狀花、舌狀花表達(dá)量。結(jié)果表明，HaFAB2在各部位均有不同程度表達(dá)，發(fā)育早期種子和成熟葉中表達(dá)較高。7DAF-17DAF兩份材料種子中表達(dá)量均較高，且均在17DAF種子中表達(dá)量最高，此時(shí)“L-1-OL-1”明顯高于“86-1”，油酸積累變化趨勢(shì)（見圖6A）結(jié)果表明，7DAF-17DAF種子油酸處于逐漸積累時(shí)期，可看出，HaFAB2基因表達(dá)量與油酸積累變化趨勢(shì)一致。17DAF之后，HaFAB2基因在大部分發(fā)育時(shí)期種子中較低表達(dá)，但在27DAF“86-1”種子中較高表達(dá)量，此時(shí)明顯高于“L-1-OL-1”（見圖6B）。

圖6 向日葵HaFAB2基因表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of HaFAB2 in sunflower

3 討論與結(jié)論

Δ9硬脂酰-ACP脫氫酶基因FAB2使硬脂酸脫飽和后形成油酸。由于FAB2催化去飽和作用是植物不飽和脂肪酸生物合成第一步，在很大程度上決定植物中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例。在玉米種子中過表達(dá)FAB2同源基因ZmSAD1，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比例提高20.40%～20.61%[14]。在棉花中利用RNA介導(dǎo)基因沉默技術(shù)干擾FAB2同源基因SAD表達(dá)，硬脂酸含量從20%提高到40%[15]。在大豆中，通過抑制FAB2基因，可增加硬脂酸含量[16]。異位表達(dá)花生FAB2提高酵母體內(nèi)油酸含量[17]。Kachroo等研究擬南芥FAB2突變體，發(fā)現(xiàn)突變體油酸含量偏低[18]。本研究克隆向日葵HaFAB2基因，并分析基因生物信息學(xué)和研究表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究HaFAB2基因功能提供參考，為通過分子育種手段改良向日葵油品質(zhì)建立基礎(chǔ)。

在大部分高等植物中，F(xiàn)AB2在各器官中均表達(dá)，但表達(dá)模式不同。FAB2同源基因SAD在油樟種子、葉和花中表達(dá)量較高，但在根和莖中表達(dá)量低[19]。在花生克隆的3個(gè)FAB2同源基因中，F(xiàn)AB2-1與FAB2-2在種子中表達(dá)量較高，隨種子發(fā)育兩者表達(dá)水平持續(xù)升高；FAB2-3在花中表達(dá)量較高，僅在種子發(fā)育早期呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)[17]。而海濱錦葵SAD在葉中表達(dá)量最高，其次是種子、莖和花中表達(dá)量最低，且隨種子發(fā)育表達(dá)量逐漸降低[20]。GhSAD2基因在棉花葉片中表達(dá)量高于莖和根；GhSAD2基因在棉花種子發(fā)育過程中表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì)，在花后25 d種子中表達(dá)量最高，在成熟種子中表達(dá)相對(duì)較弱[21]，與本研究結(jié)果相近，本研究HaFAB2基因在各部位均表達(dá)，尤其是葉、種子中表達(dá)量較高，在7DAF-17DAF兩份材料種子中表達(dá)量均較高，種子中油酸快速積累，且Ha-FAB2均在17DAF種子中表達(dá)量達(dá)到最高，此時(shí)高油酸材料中表達(dá)量明顯高于低油酸材料，HaFAB2催化硬脂酸生成油酸，因此其表達(dá)越高油酸積累較多，可看出HaFAB2基因表達(dá)量變化與油酸積累變化趨勢(shì)一致，推測HaFAB2基因是影響油酸含量的重要基因。目前已利用人工誘導(dǎo)的FAD2突變體選育出高油酸向日葵品種Pervenets，將葵花籽亞油酸含量從66%降低到30%（單基因突變體）和12%（雙基因突變體），油酸含量從20%分別上升至60%和80%[22]。目前，各國高油酸向日葵品種多是以Pervenets為基礎(chǔ)材料育成。FAD2突變顯著提高種子油酸含量，若在向日葵fad2突變體中過表達(dá)Ha-FAB2，理論上可提高種子中總不飽和脂肪酸和油酸含量，基因編輯技術(shù)發(fā)展將帶動(dòng)培育出更多高油酸向日葵新品種。

FAB2還與多種生理生化反應(yīng)以及抗脅迫相關(guān)。擬南芥FAB2突變體內(nèi)硬脂酸（C18∶0）含量增加，油酸（C18∶1）含量減少，提高水楊酸與茉莉酸介導(dǎo)的抗病反應(yīng)[23]。過表達(dá)小麥FAB2同源基因TaSSI2，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)白粉病抗性降低[24]。低溫下培養(yǎng)甘藍(lán)型油菜FAB2的一個(gè)同功基因上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致硬脂酰ACP去飽和酶含量增加[25]。RNAi的GhSAD2轉(zhuǎn)基因棉花植株相比對(duì)照，其抗寒能力減弱，耐熱能力增強(qiáng)[21]。FAB2基因還與植物抗炭疽病菌和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)[26-27]。本研究中在17DAF之后，HaFAB2基因在大部分發(fā)育時(shí)期種子中表達(dá)較低，但在27DAF“86-1”種子中表達(dá)量較高，可能與某種生理生化反應(yīng)及脅迫相關(guān)，值得未來深入研究。本試驗(yàn)初步研究HaFAB2基因在高低油酸種子表達(dá)模式，推測其在調(diào)控向日葵脂肪酸合成尤其是油酸合成可能發(fā)揮功能，但需通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)驗(yàn)證。