王揚，何樂毅凡，李龍宇，徐明杰，伍一煒，李永勝，褚夏燕，潘巧嶺，趙田甜，葉曉霞，徐暾海*，朱寅荻*，劉銅華

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中醫(yī)養(yǎng)生學北京市重點實驗室，北京 100029；3.中醫(yī)養(yǎng)生學教育部重點實驗室，北京 100029；4.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 362700；5.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

風輪菜屬植物約有22種，主要分布在東南亞的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。風輪菜Clinopodiumchinense(Benth.) O.Kuntze又名斷血流，最早記載于《救荒本草》[2]，為唇形科風輪菜屬植物風輪菜的干燥地上部分[3]，是《中華人民共和國藥典》2015年版記載的一種常用的傳統(tǒng)中藥材[4]。風輪菜味微苦、澀，性涼，歸肝經，具有收斂止血的功效，用于治療崩漏、尿血、鼻血、牙齦出血、創(chuàng)傷出血等各種出血癥，被認為是中醫(yī)止血良藥[5]。風輪菜中含有黃酮、三萜皂苷[6]、二萜[7]、揮發(fā)油和脂肪酸[8]等類型化合物，這些成分具有抗炎、治療糖尿病[9]、抗氧化、抗腫瘤和抗心肌缺血[10]等活性，其中黃酮和三萜皂苷類化合物是其主要活性成分，具有較好的開發(fā)利用前景。因此，本課題在前期研究基礎上，對風輪菜的化學成分進行研究，從70%乙醇水溶液提取物中分離得到1個新的三萜皂苷類化合物3β，16β，23，28-四羥基-11α-甲氧基-30-醛基-齊墩果-12(13)-烯-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-巖藻糖苷，命名為風輪菜皂苷H(clinopodiside H)。

1 材料

風輪菜購買于安徽省亳州市中藥材市場，經溫州醫(yī)科大學藥學院汪洪副教授鑒定為唇形科風輪菜屬植物風輪菜C.chinense(Benth.) O.Kuntze。樣品標本(20170820)現(xiàn)存于溫州醫(yī)科大學藥學院。

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振儀(德國Bruker公司)；LTQ-Obit rap XL型質譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；YMC Pack ODS-A型半制備色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；柱色譜和薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠)；D101型大孔樹脂(南開大學)；C18反相填料(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；D-吡喃葡萄糖(批號：110833-201205，純度>99.5%，國藥集團化學試劑有限公司)；D-吡喃巖藻糖(批號：10179351，純度>99%，Alfa Aesar公司)；所用化學試劑均為分析純(常熟市楊園化工有限公司)；水為實驗室儀器自制超純水(杭州永潔達凈化科技有限公司)。

2 提取與分離

風輪菜的干燥地上部分用70%乙醇水溶液在80 ℃提取2次，每次2 h，濾過濃縮得到乙醇提取物，加適量水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶劑得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

取正丁醇萃取物，經D101型大孔樹脂分離，用乙醇-水(3∶7、1∶1、7∶3和1∶0)梯度洗脫。取乙醇-水7∶3洗脫部位經正相硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，回收溶劑，經薄層色譜檢視，合并相似組分得到16個部位(Fr.Z1～16)。Fr.Z12經中壓反相柱色譜，以甲醇-水(3∶7～1∶0)梯度洗脫，經薄層色譜檢視，合并相似組分得到8個組分Fr.Z12-1～12-8，將Fr.Z12-6經葡聚糖凝膠柱色譜和高效液相制備色譜分離純化，得到化合物1(6 mg)。

3 酸水解

取所分離得到的化合物11 mg溶解于1 mL三氟乙酸-水溶液中，在95 ℃水浴回流2 h。冷卻至室溫，用等體積的二氯甲烷連續(xù)萃取3次。水層減壓濃縮干燥后反復多次加入無水乙醇旋蒸除去三氟乙酸。與單糖標準品在展開系統(tǒng)(三氯甲烷-甲醇-水8∶5∶1)下層進行薄層色譜(TLC)檢測，確定水解得到的單糖種類。用2 mL無水吡啶溶解水層樣品，再加入1.5 mg的L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽，密封，60 ℃加熱1 h。冷卻至室溫，再加入三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷(1∶2，0.5 mL)，密封，60 ℃加熱30 min。取單糖標準品D-吡喃葡萄糖、D-吡喃巖藻糖(各1 mg)加入1.5 mg的L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽，用2 mL無水吡啶溶解，密封，60 ℃加熱1 h。再加入三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷(1∶2，0.5 mL)，密封，60 ℃加熱30 min。樣品離心，取上層進行氣相色譜分析[11]。

4 結構鑒定

1H-NMR(CD3OD，600 MHz)譜顯示結構中存在化學位移為δH0.74，0.97，1.04，1.10，1.35的5個甲基單峰，1個雙峰甲基δH1.26(3H，d，J=6.6 Hz)，1個醛基質子δH9.47(1H，s，-CHO)[12]，2個連氧的亞甲基信號δH3.61，3.86，4個連氧的次甲基信號。13C-APT(CD3OD，150 MHz)譜顯示化合物共有49個碳信號，其中包括苷元31個碳和糖基的18個碳，苷元部分含有5個甲基(δC13.3，18.2，18.9，27.0，24.5)、2個羥甲基(δC68.2，C-28；64.7，C-23)、1個醛基碳信號(δC208.4，C-30)、2個烯碳(δC123.9，C-12；148.4，C-13)和1個連氧次甲基(δC84.4，C-3)。通過該化合物的相對分子質量、氫譜和碳譜數(shù)據分析，推斷其為Δ12-齊墩果烯。通過HMBC和HSQC可知C-16的化學位移為67.37，連有1個羥基，H-16和H-27的NOE相關得到16-OH為β構型。HMBC譜顯示H-24與C-3(δC84.4)、C-4(δC44.7)有遠程相關，H-12(δH5.52，d，J=3.6 Hz)與C-9(δC53.1)、C-11(δC77.6)、C-13(δC148.4)、C-14(δC44.9)有遠程相關，H-23與C-4(δC44.7)、C-5(δC48.4)有遠程相關。在HMBC譜中H-3與C-24有遠程相關，H-24和H-23都與C-4有相關，由HMBC和NOESY可知C-24連有甲基，C-23連有羥甲基。該化合物烯碳的化學位移與齊墩果烷中C-12，13是雙鍵時化學位移值相近，故該化合物的烯碳位于12，13位，HMBC中H-12與C-11有相關，C-11的化學位移向高場位移，接有1個含氧基團，而且H-11與-OMe的碳有相關，通過HSQC可知-OMe的化學位移為δH3.28，與甲氧基的一般化學位移值接近，且峰形為單峰，故C-11位連有1個甲氧基。H-3(δH3.61)和H-5(δH1.24)，H-24(δH0.74)和H-25(δH1.10)的NOE相關得到3-H為β構型。H-11(δH3.85)和H-25，H-11和H-26的NOE相關得到H-11為β構型，由此得出苷元為3β，16β，23，28-四羥基-11α-甲氧基-30-醛基-齊墩果-12(13)-烯部分。

化合物1的核磁共振數(shù)據顯示有3個糖基，分別是1個β-D-巖藻糖基和2個β-D-葡萄糖基，糖的端基碳信號為δC103.6，104.9，105.5(C-1″，1′，1?)，由HSQC實驗確定其對應的氫分別是δH4.86(d，J=7.8 Hz)、4.48(d，J=7.8 Hz)、4.60(d，J=7.8 Hz)。HMBC實驗顯示C-3和H-1′、H-1′和C-2′/C-3′、C-2′/C-3″和H-1″、C-3′/C-3?和H-1?之間有遠程相關，且C-3的化學位移向低場位移，說明巖藻糖基的C-1′連接在苷元C-3位上的羥基，2個葡萄糖基分別連接在巖藻糖基的C-2′和C-3′上的羥基，在COSY譜中H-1″和H-2″、H-1?和H-2?有相關峰。由端基氫(δH4.48，d，J=7.8 Hz，H-1′)與附近H-2′的偶合常數(shù)確定巖藻糖為β構型，2個葡萄糖的端基氫分別為δH4.86(d，J=7.8 Hz，H-1″)和δH4.60(d，J=7.8 Hz，H-1?)，在NOESY譜中H-1″和H-3″相關，H-1?和H-1′相關，確定2個葡萄糖基為β構型。對化合物1進行酸水解，用氣相色譜檢測經半胱氨酸甲酯鹽酸鹽衍生化和甲基化反應的水解的糖部分，并與單糖標品比對，進一步確證糖的絕對構型為D-巖藻糖基和D-葡萄糖基。見圖1～2和表1。

表1 化合物1的1H(600 MHz)和13C(150 MHz)NMR數(shù)據(CD3OD)

圖1 化合物1的關鍵COSY和HMBC相關

綜上所述，化合物1確定為3β，16β，23，28-四羥基-11α-甲氧基-30-醛基-齊墩果-12(13)-烯-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-巖藻糖苷，命名為風輪菜皂苷H(clinopodiside H)。

圖2 化合物1的關鍵NOESY相關

5 結果與討論

本實驗對風輪菜進行了化學成分的研究，從75%乙醇水提取物的正丁醇萃取部位分離得到1個新的三萜皂苷化合物。三萜皂苷類成分是風輪菜主要的藥理活性成分。本研究為尋找風輪菜屬植物中新的、高效的生物活性成分提供參考。