羅曉東，吳志明，李海秀，吳歡，張聲源，廖富林，肖光文*

1.嘉應(yīng)學(xué)院 廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514015；2.嘉應(yīng)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031

毛排錢草Phyllodiumelegans(Lour.) Desv.別名錢串草、疊錢草、鱗貍鱗、連里尾樹等，為豆科排錢樹屬PhyllodiumDesv.植物，分布在福建、廣東、海南、廣西及云南等省區(qū)，是我國瑤族常用的民族藥。其主跌打瘀腫、風(fēng)濕痹痛、慢性肝炎，具有消炎解毒、活血利尿、清熱下痢等功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、慢性肝炎、小兒疳積、乳癰、瘰疬等癥[1]。

目前，針對毛排錢草的藥理活性研究主要側(cè)重于其對肝炎的治療，而抗炎、抑菌等藥理活性研究較少。文獻資料顯示，排錢樹屬植物化學(xué)成分以生物堿類為主，還含有醇類、萜類、酚類、黃酮類、糖類和芳香類等化合物[2]，具有抗炎、抑菌、抗肝炎、抗腫瘤等活性[3-4]。課題組在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)毛排錢草對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌活性，但其藥用活性部位不明確，活性物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰。因此，本研究以毛排錢草為研究對象，考察其根、莖和葉3個不同藥用部位醇提物的抑菌活性，以篩選活性藥用部位，明確活性物質(zhì)基礎(chǔ)，進而探討其在不同環(huán)境條件下的抑菌穩(wěn)定性，為毛排錢草的藥用價值的開發(fā)及天然食品防腐劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

毛排錢草于2018年9月購自廣西省玉林市博白縣，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物教研室翟明講師鑒定為豆科排錢樹屬植物毛排錢草P.elegans(Lour.) Desv.。留樣保存于客家養(yǎng)生保健研究所客家中草藥化學(xué)實驗室。實驗所用菌種包括金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538、藤黃微球菌MicrococcusluteusATCC49732、大腸埃希菌EscherichiacoliATCC25922、銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC9027、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC6633、變形桿菌ProteusvuigarisATCC13315，均來源于廣東省菌種保藏中心，保存于嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原教研室。

青霉素鈉原料藥(批號：6121010150，純度≥99%)、硫酸鏈霉素原料藥(批號：73210101100，美國藥典級)，美國Genview公司；95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮等均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水為滅菌蒸餾水；MH瓊脂培養(yǎng)基(批號：190306)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：190308)均購自江門凱林貿(mào)易生物公司。氯化鈉、氯化鉀、無水氯化鈣、三氯化鐵、氫氧化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；無水檸檬酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 儀器

FL-30型流水式高速中藥粉碎機(瑞安市富力中藥機械廠)；N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；TG16-WS型臺式高速離心機(長沙維爾康湘鷹離心機有限公司)；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；BSC-1100ⅡA2-X型超凈工作臺(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；PB-21型酸度計[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；WFH-203B型三用紫外分析儀(上號精科實業(yè)有限公司)；WGZ-XT型細菌濁度儀(杭州齊威儀器有限公司)。

2 方法

2.1 毛排錢草不同藥用部位的體外抑菌活性測定

2.1.1不同藥用部位醇提物的制備 稱取毛排錢草根、莖、葉干品100 g，粉碎，分別加入95%乙醇浸泡過夜，室溫下超聲(功率：250 W，頻率：45 kHz)提取3次，每次30 min，真空抽濾，合并3次濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，分別得毛排錢草根、莖、葉醇提物浸膏10.22、7.10、10.50 g。將各提取物用40%丙酮-蒸餾水溶液溶解，制備成生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的藥液(相當(dāng)于根、莖、葉藥液每毫升分別含有0.102 2、0.071 0、0.105 0 g醇提物浸膏)，密封置4 ℃冰箱保存，備用，實驗前均用0.22 μm微孔濾膜除菌。

2.1.2對照液的制備 空白對照液：40%丙酮-蒸餾水溶液。陽性藥對照液：將40%丙酮-蒸餾水溶液作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為青霉素鈉128 μg·mL-1和硫酸鏈霉素300 μg·mL-1的藥液。

2.1.3菌懸液的制備 超凈工作臺內(nèi)，從斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，轉(zhuǎn)接1次。使用前用生理鹽水稀釋各實驗菌株至0.5麥氏濁度(相當(dāng)于1.5×108CFU·mL-1)，再取適量菌懸液，用生理鹽水或肉湯培養(yǎng)基稀釋至1.5×106CFU·mL-1，備用。

2.1.5最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定 采用微量肉湯稀釋法測定MIC。超凈工作臺內(nèi)，取一次性無菌96孔培養(yǎng)板，第2孔至第11孔均加入100 μL肉湯培養(yǎng)基，再分別吸2.1.1項制備的藥液100 μL注入第1、2孔，反復(fù)吹打，充分混勻后從第2孔中吸100 μL注到第3孔，如此等倍稀釋，至第10孔吹打混勻后棄去100 μL；第11孔不加入藥液，以觀察菌是否適宜生長；第12孔注入200 μL肉湯培養(yǎng)基，以此判斷培養(yǎng)基是否被污染。隨后分別向上述1～11孔中注入含1.5×106CFU·mL-1各實驗菌的肉湯培養(yǎng)基100 μL，充分混勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出觀察生長情況，以培養(yǎng)基澄清透明或無沉淀為無菌生長，將無菌生長實驗孔中最低生藥濃度記作MIC。

分別從無菌生長實驗孔中吸取培養(yǎng)基100 μL分別注到MH瓊脂培養(yǎng)基表面，涂布均勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，取出觀察結(jié)果，用活菌計數(shù)法計數(shù)菌落，將平均菌落數(shù)<5的最小生藥濃度記作MBC。以上實驗平行操作3次。

2.2 毛排錢草根不同極性提取物的體外抑菌活性測定

2.2.1不同極性部位提取物的制備 稱取1 kg毛排錢草根經(jīng)粉碎后，按照2.1.1項下方法制得毛排錢草根的醇提物浸膏102.26 g。取90 g浸膏超聲分散于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～5次，合并萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，分別得石油醚部位1.10 g、乙酸乙酯部位5.07 g、正丁醇部位18.64 g、水部位61.14 g，樣品均置于干燥西林瓶中密封保存?zhèn)溆?。將各樣品?0%丙酮-蒸餾水溶液溶解，制備成生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的藥液(各層藥液每毫升分別含有0.001 2、0.005 7、0.021 1、0.069 3 g浸膏)，密封置4 ℃冰箱保存，備用，實驗前均用0.22 μm微孔濾膜除菌。

2.2.2抑菌活性評價 依次吸取2.2.1項制備的藥液，按照2.1.4項下方法評價各極性部位藥液對 6種菌的抑菌活性。依次吸取2.2.1項制備的藥液，按照2.1.5項下方法分別測定各極性部位藥液對6種菌的MIC和MBC。

2.3 毛排錢草根正丁醇部位抑菌穩(wěn)定性研究

2.3.1熱穩(wěn)定性研究 參考陳佳佳等[6]實驗方法，將生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的毛排錢草根正丁醇部位藥液于60、80、100、121 ℃條件下(其中60、80、100 ℃于水浴鍋中水浴30 min，121 ℃于高壓蒸汽鍋中濕熱處理30 min)處理后，以金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌作為指示菌，采用牛津杯法測定其抑菌活性，并以未經(jīng)處理過的藥液(40 ℃)作為對照。

2.3.2紫外線穩(wěn)定性研究 參考李晨等[7]實驗方法略作修改，將生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的毛排錢草根正丁醇部位藥液置于紫外燈(254 nm)下照射10、20、30、60 min后，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別作為指示菌，以未經(jīng)處理過的藥液(0 min)作為對照。

2.3.3酸堿穩(wěn)定性研究 參考任先偉等[8]實驗方法略作修改，用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1檸檬酸調(diào)節(jié)毛排錢草根正丁醇部位藥液的pH，分別調(diào)整pH為3、5、7、9、11，同時藥液的生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，平衡30 min，以金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別作為指示菌，并以未經(jīng)處理過的藥液(pH=5.9)作為對照。

2.3.4金屬離子穩(wěn)定性研究 參考張媛媛[9]實驗方法，在毛排錢草根的正丁醇提取物中分別加入NaCl、KCl、CaCl2和FeCl3，分別配制成含0.05 mol·L-1的Na+、K+、Ca2+和Fe3+溶液，同時藥液的生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，靜置3 h，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別作為指示菌，以未經(jīng)處理過的藥液作為對照。

3 結(jié)果與分析

3.1 毛排錢草不同藥用部位提取物體外抑菌活性

實驗結(jié)果表明，毛排錢草根、莖和葉對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌等6種菌均具有不同程度的抑菌作用，其作用強弱為根>葉>莖(見表1)。毛排錢草不同藥用部位對6種菌的MIC、MBC結(jié)果與抑菌圈測定結(jié)果吻合(見表2)。其中毛排錢草根的抑菌活性較強，對6種菌均有抑菌作用(MIC、MBC在7.81～500.00 mg·mL-1)；其次是毛排錢草葉、莖，但對大腸埃希菌無明顯抑菌活性。因此，下一步將對毛排錢草根不同極性部位進行抑菌活性評價，以明確其強活性部位。

表1 毛排錢草不同藥用部位的抑菌圈直徑 mm

表2 毛排錢草不同藥用部位提取物對各菌株的MIC和MBC mg·mL-1

3.2 毛排錢草根不同極性部位提取物體外抑菌活性

由表3、4可見，在相同生藥質(zhì)量濃度下，毛排錢草根不同極性部位對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭陽性菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，對大腸埃希菌、變形桿菌等革蘭陰性菌活性較差；總體抑菌活性表現(xiàn)為正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位，其中正丁醇部位對各種菌的MIC、MBC在15.63～125.00 mg·mL-1，對銅綠假單胞菌亦表現(xiàn)出一定的抑菌效果。因此，后續(xù)實驗以正丁醇部位作為研究對象，考察其在不同條件下對敏感菌的抑菌穩(wěn)定性。

表3 毛排錢草根不同極性部位的抑菌圈直徑 mm

表4 毛排錢草根不同極性部位提取物對各菌株的MIC和MBC mg·mL-1

3.3 毛排錢草根正丁醇部位的抑菌穩(wěn)定性

3.3.1溫度對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 與40 ℃時比較，溫度為60 ℃時，毛排錢草根正丁醇部位對金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯減弱(P<0.05)，但仍然保持敏感；隨著溫度的升高，抑菌活性持續(xù)減弱。對于銅綠假單胞菌，溫度為60～121 ℃時抑菌活性明顯減弱(P<0.001)，但隨溫度升高變化不明顯，見圖1。

注：與40 ℃比較，*P<0.05，***P<0.001。圖1 溫度對毛排錢草根正丁醇部位抑菌活性的影響

3.3.2紫外線對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 由圖2可知，隨著紫外線照射時間的延長，毛排錢草根正丁醇部位對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑大小作用不明顯；經(jīng)紫外線照射10 min后其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性降低，且隨著照射時間的推移，抑菌活性呈持續(xù)降低的趨勢(P<0.05，P<0.001)。

注：與0 min比較，*P<0.05，***P<0.001。圖2 紫外線對毛排錢草根正丁醇部位抑菌效果的影響

3.3.3pH對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 由圖3可知，與pH=5.9比較，在pH=9時，毛排錢草根正丁醇部位對敏感菌的抑菌活性較強(P<0.001)；隨著pH的降低，抑菌活性逐漸減弱。當(dāng)pH=11時，抑菌活性較pH=9時弱，但強于pH≤7。

注：與pH=5.9比較，*P<0.05，***P<0.001。圖3 pH對毛排錢草根正丁醇部位抑菌效果的影響

3.3.4金屬離子對提取物的抑菌穩(wěn)定性影響 由圖4可知，對于金黃色葡萄球菌，在一定離子濃度下，金屬離子對毛排錢草根提取物抑菌效果的抑制作用強弱為Fe3+>Ca2+>Na+>K+(P<0.001)；而對于銅綠假單胞菌，Na+、K+和Ca2+抑制作用強且相似(P<0.001)。

注：與對照組比較，***P<0.001。圖4 金屬離子對毛排錢草根正丁醇部位抑菌效果的影響

4 討論

根據(jù)體外抑菌活性的測定結(jié)果，毛排錢草根、莖、葉均存在不同程度的抑菌活性，其中根的抑菌作用優(yōu)于莖、葉。毛排錢草根不同極性部位對各菌株的MIC、MBC定量測定結(jié)果與抑菌圈直徑定性測定結(jié)果吻合，抑菌活性強弱依次為正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位，說明抑菌活性成分可能集中在毛排錢草根的正丁醇部位。此外，在對毛排錢草的化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)，其地上部分含有羽扇豆烯酮、羽扇豆醇、白樺醋醇、白樺酸、異香蘭酸、檸檬酚、異檸檬酚、白樺醋酸、原兒茶酸、香橙素、木犀草素等化合物[2，10-12]；而文獻資料亦顯示，白樺醋醇、原兒茶酸、木犀草素等均具不同程度的體外抑菌活性[13-15]，由此推測，毛排錢草根可能含有上述黃酮類、萜類或生物堿類等成分。在此基礎(chǔ)上，可進一步對毛排錢草根進行化學(xué)成分分析，探究其具有抑菌或殺菌活性的單體化合物。

在穩(wěn)定性評價結(jié)果中，經(jīng)過不同溫度加熱處理后，提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果無明顯變化，對銅綠假單胞菌的抑菌活性則明顯減弱，但仍保持一定的敏感性，可能是因為提取物中可抑制革蘭陰性菌的有效成分中部分不耐高溫，經(jīng)60～80 ℃高溫處理后失去了活性，這與吳少輝等[16]研究結(jié)果基本一致，說明提取物具有較好的熱穩(wěn)定性。而隨著紫外線照射時間的變化，提取物對銅綠假單胞菌的抑菌效果變化不明顯，但對于金黃色葡萄球菌的抑菌活性有所下降，說明提取物應(yīng)盡量避光保存。

在不同pH作用下，提取物抑菌活性均出現(xiàn)不同程度的抑制。在實驗設(shè)置的pH條件下，隨著pH的增加，提取物對敏感菌的抑菌圈直徑均高于對照組，但當(dāng)pH為11時抑菌效果出現(xiàn)減弱，說明在中性或偏堿性條件下，可能對提取物有效成分起到了協(xié)同作用，從而抑菌活性得到了增強；當(dāng)環(huán)境pH低于5.9，提取物對敏感菌的抑菌活性有所下降，說明偏酸性條件下可能破壞了提取物的抑菌活性成分，對抑菌效果產(chǎn)生了抑制。

在Fe3+、Ca2+、Na+、K+等離子作用下，提取物的抑菌活性均受到不同程度的抑制，其中Fe3+對金黃色葡萄球菌抑制作用較為明顯；在實驗過程中，加入Fe3+后藥液由酒紅色變?yōu)槟G色并且有少量沉淀產(chǎn)生，該沉淀物可能為主要活性成分與Fe3+離子絡(luò)合形成的。其他金屬離子的加入并未使藥液發(fā)生明顯變化而抑菌效果有所下降，可能是金屬離子的存在改變了細胞內(nèi)外離子濃度及滲透壓，影響了提取物的作用靶點，從而產(chǎn)生不同的抑制作用，確切原因有待進一步研究。