趙喆，李明宇，何仟，程瑾*，謝磊

1.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083；2.中國疾病預(yù)防控制中心 職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050

DNA條形碼技術(shù)是利用標準的且有足夠信息并容易擴增的短DNA片段，創(chuàng)建生物的身份識別系統(tǒng)的技術(shù)[1-3]。該方法不僅可以為生物分類學(xué)、生態(tài)學(xué)等理論研究領(lǐng)域服務(wù)，同時可以作為許多應(yīng)用領(lǐng)域的有力鑒別工具，如中藥資源鑒定、藥物及食品市場監(jiān)督等[4-14]。DNA條形碼技術(shù)通常包括DNA提取、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增、DNA測序、序列校對和鑒定分析等重要環(huán)節(jié)[1]。在DNA條形碼作為鑒定工具的實際應(yīng)用過程中，待鑒定的植物材料情況可能十分復(fù)雜。這種情況可能嚴重影響DNA質(zhì)量和PCR擴增過程，對鑒定成功率造成影響。

在我國，由于誤食有毒藥用植物引起的食物中毒事件多有報道[15]。中毒事件發(fā)生后，快速準確地鑒定有毒植物對開展有針對性的治療至關(guān)重要。中毒現(xiàn)場的有毒植物往往缺乏可用于形態(tài)學(xué)鑒定的關(guān)鍵性狀(如花、果等)，因此DNA條形碼技術(shù)為快速鑒定有毒植物提供了有效工具[16-17]。然而，中毒現(xiàn)場的植物材料往往經(jīng)過了高溫處理甚至經(jīng)過了胃液消化，是否仍然能夠用于分子鑒定工作目前仍缺乏實驗研究數(shù)據(jù)。

本研究采用直接PCR技術(shù)[18]，選取11種有毒藥用植物和1種對照材料，通過模擬常見中毒案例可能出現(xiàn)的情況，設(shè)計了21種實驗材料處理條件，并對每種處理分別使用6對常用引物進行擴增、測序和分子鑒定，從而檢驗不同材料處理方法對PCR擴增與測序的影響，為DNA條形碼技術(shù)在有毒植物鑒定中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取常見的11種有毒藥用植物和1種對照植物，共9科12屬12種，所有植物樣本均經(jīng)北京林業(yè)大學(xué)自然保護區(qū)學(xué)院謝磊副教授進行準確形態(tài)學(xué)鑒定(見表1)。掌葉半夏和芹取自北京林業(yè)大學(xué)溫室，互葉醉魚草和花菱草取自北京藥用植物園，其他植物材料均來自野外采集。

表1 實驗樣品及標本信息(APG IV分類系統(tǒng))

1.2 樣品處理

根據(jù)實際中毒案例可能出現(xiàn)的情況，設(shè)計了新鮮葉片、沸水處理葉片、胃液處理葉片、沸水結(jié)合胃液處理葉片等樣品處理方法。結(jié)合常規(guī)硅膠干燥處理方法，共采用21種不同的材料處理方法(見表2)。

表2 植物材料的不同處理方法

人工胃液根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版[19]配制。取用37%鹽酸234 mL，加入蒸餾水766 mL稀釋至1000 mL得稀鹽酸。取稀鹽酸16.4 mL加入蒸餾水800 mL，胃蛋白酶10 g，攪拌均勻，加水稀釋至1000 mL得人工胃液。人工胃液pH為1～2，使用溫度為(37±1) ℃。

1.2.1新鮮葉片處理 將野外或溫室栽培有毒藥用植物的新鮮葉片取下，封口袋封存，立即放入4 ℃冰箱，防止水分散失。后續(xù)實驗在1～2 d內(nèi)完成。

1.2.2硅膠干燥處理 將采集到的新鮮有毒藥用植物葉片材料放入密封袋中，加入變色硅膠直至葉片完全被遮蓋，封閉密封袋。獲得硅膠干燥的植物葉片后即可稱量并完成后續(xù)實驗。

1.2.3沸水加熱處理 模擬烹飪過程，將新鮮的有毒藥用植物葉片材料置于沸水(100 ℃)中處理。使用電磁爐煮沸蒸餾水后加入新鮮植物葉片并計時，到時后用鑷子取出，用濾紙吸附凈葉片上的多余水分，稱量并完成后續(xù)實驗。

1.2.4人工胃液處理 模擬胃消化食物過程，使用消毒的一次性槍頭搗碎空燒杯中新鮮植物葉片，模擬咀嚼過程，之后加入人工胃液，直至被搗碎葉片被胃液完全浸沒。燒杯置于37 ℃水浴鍋中水浴處理20 min，期間不斷震蕩保證葉片與人工胃液接觸充分且反應(yīng)完全。取出葉片，蒸餾水沖洗后用濾紙吸附凈葉片上的多余水分，稱量并完成后續(xù)實驗。

1.2.5沸水加熱+胃液處理 蒸餾水經(jīng)過加熱煮沸后加入藥用植物葉片并計時，到時后用鑷子取出置于空瓶中，吸干凈多余水分。使用干凈的一次性槍頭搗碎沸水煮過的葉片，模擬咀嚼過程，之后加入人工胃液，直至被搗碎葉片完全浸沒。燒杯放置于37 ℃水浴鍋中水浴處理20 min，期間不斷震蕩保證葉片與人工胃液接觸充分，反應(yīng)完全。取出葉片，蒸餾水沖洗之后用濾紙吸附葉片上的多余水分，稱量并完成后續(xù)實驗。

1.3 直接PCR擴增與測序

1.3.1直接PCR擴增 為了加快分子鑒定實驗速度，采用Kasajima等[20]提出的快速獲得DNA提取液的方法用于直接PCR實驗。配制Edwards溶液[Tris-HCl(pH=7.5)200 mmol·L-1，EDTA(乙二胺四乙酸)25 mmol·L-1；NaCl 250 mmol·L-1，0.5%SDS(十二烷基硫酸鈉)]、TE Buffer[Tris-HCl(pH=8)10 mmol·L-1，EDTA 1 mmol·L-1][21]。取TE Buffer 10倍稀釋Edwards溶液，即獲得快速提取液，存于瓶中備用。

取3～5 mg經(jīng)過不同處理的有毒藥用植物葉片組織，進行稱量并記錄質(zhì)量，置于研缽中稍許研磨；加入200 μL快速提取液，沿同一方向快速研磨至勻漿狀，無肉眼可見塊狀碎片，收集于1.5 mL的離心管中。再向研缽中加入200 μL提取液，沖洗研缽中殘留液體，將液體小心收集于離心管中，防止DNA損失。加入400 μL ddH2O稀釋提取液并小心上下顛倒，混勻；12 000 r·s-1離心5 s(離心半徑8 cm)，移取出上清液直接用于PCR擴增。

選取5個常用于植物DNA條形碼片段的6對不同引物進行擴增[22-24]，引物信息見表3。PCR總體系為25 μL，其中包括DNA模版1 μL，dd H2O 9.5 μL，雙向引物各1 μL，PCR master mix 12.5 μL(天根生化科技有限公司)。PCR反應(yīng)循環(huán)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，共25個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，獲得擴增產(chǎn)物。

表3 引物名稱及序列

采用1.2%瓊脂糖凝膠對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳檢測。取1 μL Novel Juice染料(Bio-Helix公司)與2 μL擴增產(chǎn)物混合進行電泳，拍照觀察結(jié)果。

1.3.2測序 PCR擴增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。測序采用末端終止法，以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，使用BigDye terminator試劑盒(Applied Biosyetems公司)與單側(cè)擴增引物做末端終止PCR反應(yīng)。反應(yīng)包程序：96 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；60 ℃延伸4 min，共30個循環(huán)。測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過純化后，用ABI 3730xl型測序儀測序。產(chǎn)生的原始序列數(shù)據(jù)使用Geneious R11[25]進行編輯處理去除機讀錯誤。

1.4 序列擴增成功率檢驗與分子鑒定分析

采用Blast法[17]將校對好的序列與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/)已經(jīng)公布的序列進行比對，相似性指數(shù)最高的匹配即為鑒定結(jié)果[17]，檢測本實驗方法的可行性，科、屬、種鑒定的準確性以及是否存在污染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增結(jié)果

對12種植物葉片采用21種不同處理后提取的DNA進行了6種不同引物的PCR擴增，結(jié)果表明，使用不同處理方法及不同引物對DNA擴增結(jié)果均有一定影響。

除psbA-trnH片段外，新鮮葉片的PCR成功率明顯高于硅膠干燥處理下的擴增成功率。在沸水加熱處理條件下，隨著沸水處理時長增加，PCR擴增成功率呈不斷降低趨勢。與未經(jīng)過胃酸處理的樣品相比，胃酸處理后樣品PCR擴增成功率降低(見圖1)。

注：橫坐標數(shù)字代表不同處理方法；1.新鮮葉片；2.硅膠干燥；3.沸水加熱10 s；4.沸水加熱20 s；5.沸水加熱30 s；6.沸水加熱5 min；7.沸水加熱10 min；8.沸水加熱15 min；9.沸水加熱30 min；10.沸水加熱45 min；11.沸水加熱60 min；12.胃液處理；13.加熱10 s后使用胃液處理；14.加熱20 s后使用胃液處理；15.加熱30 s后使用胃液處理；16.加熱5 min后使用胃液處理；17.加熱10 min后使用胃液處理；18.加熱15 min后使用胃液處理；19.加熱30 min后使用胃液處理；20.加熱45 min后使用胃液處理；21.加熱60 min后使用胃液處理。圖1 不同引物對不同處理方法藥用植物DNA擴增結(jié)果的影響

ITS引物擴增的樣品無論是否進行胃酸處理，在加熱15 min以內(nèi)其擴增成功率均可以達到較高水平。而rbcL引物在加熱10 min的處理下仍可保證較高的擴增成功率，即使是在胃酸處理后也能保持較高的成功率。使用atpB-rbcL引物的擴增效果在相同處理條件下PCR成功率略低于前2個引物。變異速率最快、GC含量較低的psbA-trnH引物相對于其他5種引物總體的PCR擴增成功率最低，而沸水加熱處理在15 min內(nèi)對該引物PCR擴增成功率沒有影響，超過15 min成功率顯著下降。matK(390f)與matK(472F)引物比較，在加熱5 min內(nèi)前者的擴增成功率略高，而在胃酸處理下后者擴增成功率更高。

2.2 序列檢測結(jié)果

將擴增成功的PCR產(chǎn)物進行DNA測序。一些PCR反應(yīng)雖然可以檢測出明顯的條帶，但是由于PCR產(chǎn)物濃度不高或序列存在特殊結(jié)構(gòu)等原因不能成功測序。對于本研究的12個植物種類，最終有11個種類獲得了ITS和matK(2個引物結(jié)果相同)序列，所有種類都獲得了rbcL序列，而10個種類獲得了atpB-rbcL 和psbA-trnH序列。無論哪種材料處理方法，北馬兜鈴的ITS片段測序失敗，毛茛的matK片段測序失敗，掌葉半夏和一把傘南星的atpB-rbcL片段測序失敗，一把傘南星和商陸的psbA-trnH片段測序失敗。

2.3 分子鑒定成功率

將校對好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索，檢索結(jié)果以相似性最高的匹配為準。根據(jù)最高匹配結(jié)果，統(tǒng)計了各引物在科、屬、種水平上的鑒定正確率。在科、屬、種水平上，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與Blast結(jié)果完全一致的記為鑒定正確，不一致的記為鑒定錯誤。結(jié)果表明，對于所有獲得的條碼序列，使用Blast方法在科水平上的鑒定結(jié)果正確率為100.00%(見表4)，在屬水平上，僅有花菱草的atpB-rbcL片段鑒定結(jié)果為博落茴屬植物，其他鑒定均正確。而在種水平上，除了ITS片段之外，其他所有序列的鑒定成功率均較低，其中rbcL的種級鑒定成功率最低，psbA-trnH在葉綠體片段種級鑒定成功率最高。

表4 6種引物擴增片段在科、屬、種水平上的鑒定成功率 %

3 討論

常規(guī)的DNA提取方法操作一般較為復(fù)雜，步驟常涉及植物組織破碎、細胞裂解、酚氯仿萃取、異戊醇抽提等，耗時較多且需大量有毒試劑，不符合鑒定所需的快速簡便的要求。直接PCR技術(shù)操作簡便、耗時較短，大大降低了分子鑒定的工作量。本研究采用的DNA制備法相較于傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法、試劑盒提取等方法，實驗操作簡便快捷。整個實驗操作無需使用液氮研磨，使用試劑種類少，操作步驟簡單，少有離心的過程，獲得用于PCR擴增的DNA僅需數(shù)分鐘，符合快速鑒定要求。同時，本方法對實驗室條件要求較低，需要的實驗器材和試劑種類少，使用的試劑均為實驗室常備試劑，配制簡單，不需要三氯甲烷、苯酚等傳統(tǒng)常用DNA提取試劑，減少了有毒試劑的使用。此外，常規(guī)方法提取DNA要求的植物組織材料往往較多，常在100 mg左右。而本研究提供的方法需要的材料用量少，僅需3～5 mg葉片即能提取出適用于后續(xù)PCR擴增測序的DNA片段。

有研究表明，直接PCR技術(shù)只宜針對某些特定植物，難以大規(guī)模采用，且提取到的DNA質(zhì)量較低，含有大量雜質(zhì)，無法滿足PCR擴增鑒定要求[26-27]。從本研究的PCR擴增和測序成功率來看，該方法的確在掌葉半夏、一把傘南星、北馬兜鈴等植物的某些片段擴增中無法取得成功，但對測試的絕大多數(shù)實驗材料都能成功獲得DNA條碼序列，說明該方法對有毒藥用植物的分子鑒定具有一定的普遍適用性。

本研究的直接PCR方法也存在一些明顯的不足。為了縮短實驗時間，DNA制備沒有去除雜質(zhì)過程，因此DNA提取液無法長久保存，只能當時進行PCR檢測。此外，DNA提取液中不可避免的存在阻抑PCR反應(yīng)的次生代謝物質(zhì)。因此，在PCR擴增失敗后可通過加入ddH2O稀釋DNA提取液的方法降低阻抑物濃度，以達到提高PCR成功率的目的。另外，實驗結(jié)果表明，硅膠干燥處理的植物材料PCR成功率普遍低于新鮮葉片材料。這可能是因為植物失水導(dǎo)致植物中的多糖、多酚以及其他代謝產(chǎn)物含量相對增加，使得DNA提取液中PCR反應(yīng)阻抑物質(zhì)濃度提高。

對植物材料的長時間高溫處理會造成DNA嚴重降解。朱軍民等[28]已研究證明100 ℃處理DNA，在5 min以上就會引起DNA分子不同程度的損害。本研究結(jié)果表明，短時間沸水處理的植物葉片材料仍可以用于直接PCR方法。經(jīng)過10、20、30 s沸水煮后的葉片使用本提取方法均可在PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測中呈現(xiàn)清晰的目的條帶，其產(chǎn)物也可以成功進行測序。沸水處理在1 min以內(nèi)，對PCR實驗結(jié)果幾乎沒有影響，多數(shù)植物材料經(jīng)過煮沸5、10 min后仍能通過本方法進行PCR擴增，而煮沸15 min以上PCR成功率下降明顯。因此，如果在實際中毒案例中，有毒植物經(jīng)過15 min以上的高溫處理，其分子鑒定成功率較低。

本研究中人工胃液處理對PCR成功率有一定程度的影響。胃液中含有的強酸和蛋白酶對DNA會有一定程度影響，加熱處理加上咀嚼消化過程會造成DNA某種程度的降解。然而，總體來講多數(shù)胃液消化后的植物葉片材料仍能獲得較好的PCR擴增效果。一些植物材料，如互葉醉魚草，加熱結(jié)合胃液處理對PCR擴增和測序影響較小。此結(jié)果表明本研究方法可以適用于嘔吐物的鑒定。

在DNA條形碼通過測序獲得之后，可使用多種鑒定分析方法[24]。常用的DNA條形碼鑒定方法包括PWG距離法、構(gòu)樹法和Blast法等。由于前2種方法直觀性較差，耗費時間較多，而Blast法基于公共數(shù)據(jù)平臺，無需研究者自己構(gòu)建基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，操作最為直觀快捷，所以Blast鑒定方法最適合用于快速分子鑒定的實際應(yīng)用當中[17]。此方法在科、屬級水平上成功率極高，而在種的水平上成功率顯著降低。這與數(shù)據(jù)庫中缺少許多有毒植物相關(guān)DNA數(shù)據(jù)有關(guān)，在將來數(shù)據(jù)庫不斷得到豐富擴充之后，物種水平的成功率也會相應(yīng)得到提高。而且在實際中毒案例發(fā)生之后，有毒植物科、屬的準確判斷對采取有針對性的治療方法已經(jīng)充分有效。因此本研究提出的直接PCR實驗方法對于有毒植物快速鑒定具有一定的實際應(yīng)用前景。實際鑒定過程中，建議采用PCR擴增成功率高的ITS和rbcL片段相結(jié)合進行快速分子鑒定。而鑒于psbA-trnH片段在材料加熱30 min以上仍有較高的PCR成功率，且該引物的種水平鑒定成功率在葉綠體片段中最高，建議在快速鑒定中3個片段同時使用以提高總體的成功率。