黃全明 周劍輝 楊昭遠 蘭宗寶 俸祥仁

摘 要： 以健康昆明種小鼠為動物模型，一次性經(jīng)口灌服不同劑量（10.00、7.76、6.03、4.68、3.63和2.82g·kg-1 ）的金連菊復(fù)方制劑，通過開展小鼠急性毒性試驗評價其用藥安全性。結(jié)果表明：灌服不同劑量金連菊復(fù)方制劑后，小鼠首先呈現(xiàn)安靜、趴臥不動、腹式呼吸，隨著時間推移部分小鼠出現(xiàn)被毛豎立、眼球突出、尾部血管發(fā)藍等癥狀，嚴重者腹部急劇收縮、行動不穩(wěn)、抽搐死亡，但至給藥后第4 d小鼠毒性反應(yīng)基本消失;小鼠死亡現(xiàn)象主要發(fā)生在給藥后24 h內(nèi)，且呈明顯的量效關(guān)系;剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)其肺臟充血或有出血點，同時伴有胸腔積液;試驗結(jié)束后將剩余小鼠全部處死剖檢，發(fā)現(xiàn)各處理組小鼠的內(nèi)臟器官均無明顯病理變化，與正常小鼠的內(nèi)臟器官一致。通過改良寇氏計算公式得到金連菊復(fù)方制劑對小鼠的半數(shù)致死量（LD 50 ）為6.299g·kg-1 ，其標準誤差（Sx 50 ）為 0.035 5 ，95%置信區(qū)間為7.394～5.367，屬于實際無毒性物質(zhì)。

關(guān)鍵詞： 金連菊復(fù)方制劑;小鼠;急性毒性試驗;半數(shù)致死量（LD 50 ）

中圖分類號： S853.74文獻標志碼： A文章編號： 0253-2301（2020）06-0017-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.06.004

Acute Toxicity Test of Compound Preparation of Jinlianju on Mice

HUANG Quan-ming 1， ZHOU Jian-hui 2， YANG Zhao-yuan 3， LAN Zong-bao4* ， FENG Xiang-ren5*

（1. Yongfu County Agriculture and Rural Bureau， Guilin， Guangxi 541800， China; 2. Guilin Animal

Husbandry Station， Guilin， Guangxi 541000， China; 3. Institute of Animal Health in Jiangnan District

of Nanning， Nanning， Guangxi 530001， China; 4. Institute of Agricultural Science and Technology

Information， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China;

5. Guangxi Baipeng Livestock Breeding Station， Liuzhou， Guangxi 541502， China）

Abstract：By taking the healthy Kunming mice as the animal model， the compound preparation of Jinlianju was given different doses （ 10.00 ，7.76 ，6.03 ，4.68 ，3.63? and2.82???g·kg-1 ） by oral administration at one time. The acute toxicity test of mice was carried out to evaluate the drug safety. The results showed that after filling different doses of the compound preparation of Jinlianju， the mice showed quiet， laying still and abdominal breathing at first; As time went on， some mice showed clothing hair erection， protruding eyes and blue blood vessels in the tail. In the severe cases， the abdomen contracted sharply， the movement was unstable， and the mice twitched and died， but the toxic reaction of the mice basically disappeared at the 4th day after medication. The death of mice mainly occurred within 24 h after medication， and showed an obvious dose-effect relationship. The dead mice were found to have congestion in the lungs or bleeding points， as well as pleural effusion. After the end of the test， all the remaining mice were sacrificed for autopsy， and it was found that the internal organs of the mice in each treatment group had no obvious pathological changes， which was consistent with the internal organs of normal mice. By using the Karber method， theLD 50? andSx 50? of Jinlianju compound preparation for mice were obtained， being6.299 g·kg-1? and0.035 5 ， respectively. And the confidence interval of 95% was7.394-? 5.367 ， indicating that the compound preparation of Jinlianju belonged to the actual non-toxic substance.

Key words：Jinlianju compound preparation; Mice; Acute toxicity test; Median lethal dose

西藥在畜禽疫病防治上雖然具有療效快的優(yōu)勢，但易產(chǎn)生耐藥性，或?qū)游餀C體產(chǎn)生一定損傷，且存在藥物殘留的風(fēng)險，進而對人類健康產(chǎn)生間接的不利影響。中藥具有天然的保健及藥用成分，可提高機體免疫力，同時具有抗病毒及抗應(yīng)激等活性作用，毒副作用小，不易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生耐藥性[1-2] ;且我國中藥歷史發(fā)展悠久，具有上千年的應(yīng)用實踐，因此中藥在獸醫(yī)臨床應(yīng)用中優(yōu)勢巨大。復(fù)方中藥制劑是由兩種或兩種以上的中藥材組方而成，相對于單方藥物，復(fù)方中藥制劑具有提高藥物療效、減少不良反應(yīng)、改善服用藥品依從性、降低用藥成本等優(yōu)勢，目前在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用[3-4] 。中藥復(fù)方制劑安全性是進一步研究其藥理、毒理作用的基本保障，同時對評價新藥是否具備研發(fā)價值具有重要意義，即開展急性毒性試驗和亞慢性毒性試驗是評價中藥復(fù)方制劑安全性的必要環(huán)節(jié)[2，5] 。其中，根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果可初步了解試驗藥物的毒性強度和可能的靶器官，為藥物進行其他方面的試驗研究提供依據(jù)[6] 。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子等中藥對大腸桿菌 Escherichia coli 、巴氏桿菌 Pasteurella? sp.、鏈球菌 Streptococcus? sp.、沙門氏菌 Salmonella? sp.、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 和放線桿菌 Actinobacillus? sp.等 6 種豬場常見病原菌高度敏感[7] ，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出金連菊復(fù)方制劑（金銀花∶ 連翹∶ 野菊花∶ 烏梅∶ 五倍子=3∶?5∶ 5∶ 3∶ 4）[2] 。因此，需進一步開展金連菊復(fù)方制劑對昆明種小鼠的急性毒性試驗，評價用藥安全性，為其獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子等中藥原材料購自廣西玉林市中藥材專業(yè)市場。健康昆明種小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，購回后先適應(yīng)暫養(yǎng)5 d，體重18.0～22.0 g·只-1 。

1.2 試驗方法

1.2.1 中藥材處理 精確稱取金銀花60.0 g，以95%乙醇浸泡6～8 h，收集浸提液，藥渣再用95%乙醇浸泡4～6 h，合并2次浸提液后80℃加熱回流2 h，收集浸提液，過濾，濃縮至生藥含量為1.0g·mL-1 ，裝瓶備用。同時按組方配比精確稱取連翹100.0 g、野菊花100.0 g、烏梅60.0 g和五倍子80.0 g，煎煮前以5倍蒸餾水浸泡2 h，煎煮30 min后收集藥液，再加入5倍蒸餾水繼續(xù)煎煮30 min，合并2次藥液，濃縮至生藥含量為1.0g·mL-1 。室溫下 4 000 r·min-1 離心20 min，收集上清液裝瓶備用。按3∶ 17比例合并上述兩種藥液，采用手提式壓力蒸汽消毒器滅菌30 min，即獲得金連菊復(fù)方制劑。試驗前濃縮或稀釋至設(shè)計的用藥濃度。

1.2.2 試驗分組設(shè)計 選取健康昆明種小鼠共60只，雌雄各半，試驗期間飼喂小鼠全價飼料，室溫控制在25～28℃，相對濕度為40.0%～70.0%，采用自然光照，自由飲水。用藥前禁食12 h，稱重，將小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半;采用中性紅染色標記對小鼠進行常規(guī)標記。根據(jù)寇氏法按等比級數(shù)設(shè)計6個劑量組，分別一次性經(jīng)口灌服不同劑量（10.00、7.76、6.03、4.68、3.63和2.82g·kg-1 ），對應(yīng)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組。給藥后每天注意觀察記錄小鼠的精神狀況、采食飲水情況和死亡情況。

1.2.3 觀察指標 觀察給藥后0～16 h各組小鼠的反應(yīng)及死亡情況，包括小鼠的行為、動作、呼吸等是否出現(xiàn)異常，以及分泌物及排泄物情況，詳細記錄小鼠中毒癥狀和癥狀出現(xiàn)時間及死亡時間;對死亡小鼠進行剖檢，肉眼觀察各臟器有無異常，如有明顯病變，取病變組織器官制作病理組織切片作進一步觀察。在給藥當天及給藥后第4、8、12和16 d稱重，稱重前禁食12 h，最后一次稱重后將小鼠全部處死，剖檢，觀察組織器官有無病變。

1.2.4 測定指標依據(jù) 小鼠體重采用差量法測定其平均值。半數(shù)致死量（LD 50 ）采用改良寇氏法進行計算[5，8-9] ：當包含0和100%死亡率時，LD 50 =lg-1 [ X m? i （∑ P -0.5）];當不包含0和100%死亡率時，LD 50 =lg-1 { X? m-i [∑ P -1/4（3- P? m- P? n）]}。

LD 50 的標準誤差：Sx 50 = i （∑ PQ/n ）0.5

LD 50 的95%可信限=lg-1 （lgLD 50 ±1.96×Sx 50 ）

式中： i 為組距; X? m為最大劑量對數(shù); P 為各劑量組死亡率（用小數(shù)表示）; Q 為各組劑量存活率， Q =1- P ; P? m為最高死亡率; P? n為最低死亡率;∑ P 為各劑量組死亡率之和; n 為各組動物數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行整理，利用DPS進行單因素方差分析（One-wag ANOVA），并以Duncan′s新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌服不同劑量金連菊復(fù)方制劑對小鼠體重 變化 的影響

由表1可知，經(jīng)口灌服金連菊復(fù)方制劑后第4 d，Ⅰ組和Ⅱ組小鼠的體重較給藥前分別減輕7.32%和9.95%，而Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組小鼠的體重比給藥前分別增重3.92%、6.44%、6.22%和10.14%，其中Ⅴ組、Ⅵ組分別顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組（ P <0.05），Ⅲ組和Ⅳ組與其他處理組間的差異均不顯著（ P >0.05）。給藥后第8 d，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組小鼠的體重較給藥后第 4 d 的體重分別增加10.53%、6.84%、7.08%、2.33%、4.05%和7.46%，其中Ⅴ組、Ⅵ組分別顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組（ P <0.05），但與Ⅲ組和Ⅳ組的差異不顯著（ P >0.05）。至給藥后第12 d，除Ⅰ組小鼠的體重?zé)o增長外，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組小鼠的體重較給藥后第 8 d 的體重分別增加6.90%、4.41%、1.36%、5.63%和3.67%，其中Ⅵ組顯著高于除Ⅲ組和Ⅴ組外的其他3個處理組（ P <0.05）。至給藥后第16 d，各處理組小鼠的體重差異均不顯著（ P >0.05）。在整個試驗周期內(nèi)，以Ⅵ組小鼠體重的增重最明顯，平均增重5.2g·只-1 ，顯著高于Ⅱ組小鼠（平均增重2.2g·只-1 ），但與其他處理組間無顯著差異（ P >0.05）。

2.2 灌服不同劑量金連菊復(fù)方制劑后小鼠的毒性反應(yīng)癥狀

經(jīng)口灌服不同劑量金連菊復(fù)方制劑后，各處理組小鼠首先呈現(xiàn)安靜、趴臥不動、腹式呼吸，隨著時間推移部分小鼠出現(xiàn)被毛豎立、眼球突出、尾部血管發(fā)藍等癥狀，嚴重者腹部急劇收縮、行動不穩(wěn)、抽搐死亡;一些小鼠死前伴有神經(jīng)興奮癥狀，表現(xiàn)為攀爬、驚跳或鳴叫等。小鼠死亡主要發(fā)生在給藥后24 h內(nèi)，至給藥后第4 d小鼠毒性反應(yīng)基本消失，且高劑量處理組小鼠死亡率較高，呈明顯的量效關(guān)系，其中，Ⅰ組累計死亡小鼠9只，Ⅱ組累計死亡小鼠5只，Ⅲ組和Ⅳ組累計死亡小鼠均為4只，Ⅴ組累計死亡小鼠2只，Ⅵ組小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象（表2）。對死亡小鼠及時進行剖檢，觀察發(fā)現(xiàn)部分死亡小鼠的肺臟充血或有出血點，同時伴有胸腔積液。在試驗結(jié)束后將剩余小鼠全部處死，剖檢發(fā)現(xiàn)各處理組小鼠的內(nèi)臟器官均無明顯病理變化，與正常小鼠的內(nèi)臟器官一致。

2.3 金連菊復(fù)方制劑對小鼠的LD 50 及95%置信 區(qū)間

對小鼠灌服不同劑量金連菊復(fù)方制劑后的死亡情況如表3所示。將表3中的試驗數(shù)據(jù)代入改良寇氏計算公式中，可得到金連菊復(fù)方制劑對小鼠的LD 50 為6.299g·kg-1 ，Sx 50 為 0.035 5 ，95%置信區(qū)間為7.394～5.367。按照毒理學(xué)對藥物毒性的分級標準[10-11] ，LD 50 > 5 000 mg·kg-1 屬于實際無毒性物質(zhì)，因此，可確定金連菊復(fù)方制劑對小鼠安全無毒。

3 討論

急性毒性試驗是藥物毒理學(xué)評價的常用方法，可根據(jù)LD 50 對試驗藥物的毒性進行分級，初步了解其毒性強度，為藥物進行臨床用藥試驗提供參考依據(jù)[6，12-13] 。本研究結(jié)果表明，經(jīng)口一次性灌服不同劑量金連菊復(fù)方制劑后，小鼠首先呈現(xiàn)安靜、趴臥不動、腹式呼吸，隨著時間推移部分小鼠出現(xiàn)被毛豎立、眼球突出、尾部血管發(fā)藍等癥狀，嚴重者腹部急劇收縮、行動不穩(wěn)、抽搐死亡，但至給藥后第4 d小鼠毒性反應(yīng)基本消失;小鼠死亡現(xiàn)象主要發(fā)生在給藥后24 h內(nèi)，且高劑量處理組小鼠死亡率較高，呈明顯的量效關(guān)系;剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)其肺臟充血或有出血點，同時伴有胸腔積液，試驗結(jié)束后將剩余小鼠全部處死剖檢，發(fā)現(xiàn)各處理組小鼠的內(nèi)臟器官均無明顯病理變化，與正常小鼠的內(nèi)臟器官一致;此外，通過改良寇氏計算公式得到金連菊復(fù)方制劑對小鼠的LD 50 為6.299g·kg-1 ，Sx 50 為 0.035 5 ，95%置信區(qū)間為7.394～5.367，屬于實際無毒性物質(zhì)，與本課題組前期開展的大鼠亞慢性毒性試驗結(jié)果[2] 基本一致，說明金連菊復(fù)方制劑安全性好。

由于組成金連菊復(fù)方制劑的5 味中藥（金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子）均對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等 6 種豬場常見病原菌具有高度的敏感性[7] ，因此該復(fù)方中藥制劑可作為飼料添加劑應(yīng)用于斷奶仔豬的育肥養(yǎng)殖，但其給藥劑量需要通過臨床試驗進一步探究確認。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）