田榮榮 牛 童 胡 靜 肖勛澤 許新橋 王 偉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所1，北京 100091) (北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部2，北京 100094)

扁桃(Prunusdulcis(Mill.) D.A.Webb.)屬薔薇科桃屬扁桃亞屬植物[1-3]。扁桃是著名的干果和木本油料植物，與核桃、榛子、腰果并稱為四大干果，在世界范圍內(nèi)扁桃的貿(mào)易量大、交易額高[4]。我國種植扁桃有1 300年以上的歷史[3]。目前，扁桃主要集中在新疆喀什等地區(qū)，主栽品種為“紙皮”扁桃(Prunusdulcisvar. Zhipi)。該品種仁油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)54.7%～57.7%[3]，其中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)92.3%[5]，以油酸、亞油酸為主，可作為高檔食用油，具有開發(fā)為基礎(chǔ)油、按摩油、發(fā)用油、防銹油以及高檔化妝品的潛力[3]。

水酶法是以水為介質(zhì)，在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上利用酶對植物組織的降解作用釋放油脂的工藝。在我國，以水為介質(zhì)制備芝麻油的歷史長達(dá)1 600多年。水酶法中纖維素酶、果膠酶等能破壞細(xì)胞壁，而蛋白酶則滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi)，對脂多糖、脂蛋白進(jìn)行降解，這有利于油脂從脂質(zhì)體中釋放，進(jìn)一步提高以水為介質(zhì)提取油脂的效率[6-9]。水酶法的條件溫和，酶解溫度低，無需借助有機(jī)溶劑以及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的條件，得到的油脂成色好，副產(chǎn)物蛋白質(zhì)等變性程度小[10]。

響應(yīng)面優(yōu)化即響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法(Response Surface Methodology，RSM)，其通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析獲得最優(yōu)工藝參數(shù)的一種高效方法。響應(yīng)面優(yōu)化被廣泛應(yīng)用到水酶法提取油脂工藝優(yōu)化中，王新明等[9]利用響應(yīng)面優(yōu)化了紅樹莓籽油工藝油的制備工藝，高定烽等[11]利用響應(yīng)面優(yōu)化了芥末籽油的制備工藝。

本研究以“紙皮”扁桃為原料，采用水酶法制備“紙皮”扁桃油，在料液比、酶添加量、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度等單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面設(shè)計(jì)獲得最佳工藝參數(shù)，以期為“紙皮”扁桃等油脂資源利用和開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

“紙皮”扁桃種仁，產(chǎn)自新疆喀什(陰干，含水量4.88%)，取仁、去皮、磨碎、過40目篩后-18 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

氫氧化鈉、鹽酸、石油醚：分析純；果膠酶Pectinex Ultra SP-L、纖維素酶Celluclast 1.5L、水解蛋白酶Alcalase 2.4L、風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme 500MG、中性蛋白酶Neutrase 1.5MG、復(fù)合蛋白酶Protamex。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FSJ-A05B1型多功能粉碎機(jī)，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，Kaida TGL16M型離心機(jī)，SCILOGEX MX-S渦旋振蕩器，F(xiàn)ive Easy Plus臺(tái)式pH計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 水酶法制備油脂工藝流程

稱取定量樣品，按料液比加入水，渦旋振蕩2 min，調(diào)pH后，按實(shí)驗(yàn)需要加入適宜酶活單位的酶，渦旋振蕩2 min，經(jīng)恒溫水浴提取后，利用冷凍解凍破乳(-20 ℃冷凍15 h以上，水浴鍋40 ℃水浴解凍)后，5 000 r/min 離心20 min，收集上層油相(清油)，并稱重，棄去乳相及水相，計(jì)算出油率。

出油率=(上層清油質(zhì)量/脂肪含量)×100%

1.2.2 總含油率的測定

準(zhǔn)確稱取定量樣品，用濾紙包好后，置于索氏提取器中，加入4倍量的石油醚，加熱提取4 h；每份樣品重復(fù)提取3次，50 ℃下減壓蒸餾回收石油醚，真空干燥箱中干燥至恒重，得“紙皮”扁桃油，計(jì)算總含油率(油脂含量)。

總含油率=油脂總量/樣品質(zhì)量×100%

1.2.3 酶的篩選

稱取5 g過40目篩“紙皮”扁桃仁粉末，料液比1∶5，酶解5 h，各種蛋白酶統(tǒng)一添加酶活6 000U/5 g，果膠酶和纖維素酶添加量為1%。各種酶最適酶解條件：中性蛋白酶pH 7.0，溫度50 ℃；復(fù)合蛋白酶pH 7.0，溫度50 ℃；水解蛋白酶pH 8.5，溫度40 ℃；風(fēng)味蛋白酶pH 6.0，溫度40 ℃；果膠酶pH 5.5，溫度55 ℃；纖維素酶pH5.5，溫度55 ℃。

1.2.4 酶的配比

在pH值5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，固定果膠酶活性為800 U/5 g 調(diào)整水解蛋白酶添加活性，水解蛋白酶添加活性為4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/5 g。

在pH值5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，固定水解蛋白酶活性為6 000 U/5 g調(diào)整果膠酶添加活性，果膠酶添加活性為200、400、800、1 200、1 600 U/5 g。

1.2.5 酶的添加順序

在pH 5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，酶添加比例果膠酶∶水解蛋白酶=1∶5，對果膠酶和水解蛋白酶同一時(shí)間加入與先加入果膠酶酶解3 h后再加入水解蛋白酶酶解2 h進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選

如圖1所示，各種酶與對照(出油率1.67%)相比出油率有不同程度的提高，其中，復(fù)合蛋白酶出油率最高達(dá)12.44%，其次是水解蛋白酶(11.99%)和果膠酶(11.60%)，纖維素酶出油率(2.22%)最低。復(fù)合蛋白酶出油率提升最高，說明酶的復(fù)合使用更有利于油脂的提取。胡濱等[6]利用復(fù)合酶制劑對絲瓜籽提取油脂同樣獲得了較好的效果。蛋白酶中水解蛋白酶出油率最高，達(dá)11.99%。水解蛋白酶主要作用于絲氨酸內(nèi)部肽鍵，這說明“紙皮”扁桃油體細(xì)胞中的油脂可能被含有絲氨酸較多的蛋白質(zhì)膜結(jié)構(gòu)束縛。果膠酶主要作用于果膠和其他半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)中的α-1,4半乳糖苷鍵，與對照相比果膠酶顯著提升了出油率，出油率達(dá)11.60%，這可能是果膠位于釋放油脂分子的關(guān)鍵位置上。這與孫月娥等[10]利用果膠酶提取巴旦木油和水解蛋白效果最顯著的結(jié)果一致。纖維素酶效果差于果膠酶，纖維素酶主要作用于纖維素中的β-1,4糖苷鍵，與對照相比加入纖維素酶對出油率提升有限，可能是因?yàn)槔w維素中β-1,4糖苷鍵的水解對“紙皮”扁桃油脂的釋放影響較小，而對絲瓜籽等油脂的釋放可能起到至關(guān)重要的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)使用的商品化復(fù)合蛋白酶，配方未知不利于后期提取工藝的優(yōu)化。綜上所述，本研究選用果膠酶與水解蛋白酶進(jìn)行復(fù)配提取“紙皮”扁桃油。

圖1 酶的種類對出油率的影響

2.2 酶的添加順序

由圖2可見，果膠酶和水解蛋白酶同時(shí)加入，出油率略低于分步加入。推測是因?yàn)楣z酶的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，水解蛋白酶酶解果膠酶從而影響果膠酶的活性，一定程度上降低兩種酶復(fù)配的效果。分步加入酶對出油率提高效果有限，對比出油率差異不顯著。調(diào)整酶添加順序不能有效地提高出油率，為減少操作步驟，控制生產(chǎn)過程中的成本，本研究仍采用同時(shí)加入兩種酶開展后續(xù)工藝優(yōu)化。使用復(fù)配酶提取油脂，大部分是采用同時(shí)加入，張會(huì)彥等[7]采用同步加入中性蛋白酶與戊聚糖酶用于胡麻籽油的提取。

注：“果”為果膠酶，“水”為水解蛋白酶。圖2 酶添加順序?qū)Τ鲇吐实挠绊?/p>

2.3 酶的添加量

由圖3可知，果膠酶固定添加800 U/5 g，水解蛋白酶用量6 000 U/5 g時(shí)，出油率最高，達(dá)到31.08%。水解蛋白酶固定添加6 000 U/5 g，果膠酶用量為1 200 U/5 g時(shí)，出油率最高，達(dá)到37.75%。故選擇水解蛋白酶添加活性為6 000 U/5 g和果膠酶添加活性為1 200 U/5 g(酶活性比例果膠酶∶水解蛋白酶=1∶5)復(fù)配，開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。李曉等[12]在紅花籽油水酶法提取中添加酶活比例木聚糖酶:果膠酶堿性蛋白酶=1∶2∶3時(shí)提取率高達(dá)73%，這說明不同原料提取油脂對果膠酶的需求不同。

注：1～5分別表示800 U∶4 000 U，1 000 U∶5 000 U，1 200 U∶6 000 U，1 400 U∶7 000 U，1 600 U∶8 000 U(果膠酶∶水解蛋白酶)。圖3 酶添加量對出油率的影響

2.4 酶的配比

pH 5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5，固定酶添加比例果膠酶∶水解蛋白酶=1∶5，添加量分別為800 U∶4 000 U，1 000 U∶5 000 U，1 200 U∶6 000 U，1 400 U∶7 000 U，1 600 U∶8 000U(果膠酶∶水解蛋白酶)，酶解5 h。結(jié)果見圖3。

“紙皮”扁桃的出油率，在一定范圍內(nèi)隨著酶的添加量的增加而提高，果膠酶∶水解蛋白酶=1 400 U∶7 000 U時(shí)出油率達(dá)到最高。再增加酶的添加量，出油率反而下降，可能是因?yàn)槊缸鳛榈鞍踪|(zhì)，過量后有表面活性劑的作用，促進(jìn)了油脂乳化，不利于其析出。

2.5 料液比對出油率的影響

在pH 5.5、溫度55 ℃，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶ 6 000 U，酶解5 h，研究料液比對出油率的影響。改變料液比分別為1∶4、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同處理對出油率的影響

隨著料液比中液體比例的增加，“紙皮”扁桃的出油率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在1∶7之后變化不明顯。液體占比小，物料黏稠度較大，不利于酶接觸催化物料；液體占比過大，反應(yīng)體系中酶與物料濃度均降低，減少了酶和物料中的底物分子發(fā)生接觸的概率。因此液體占比過小或者過大均不利于油脂的提取。針對“紙皮”扁桃當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，出油率達(dá)到最高，故選擇料液比為1∶5。

2.6 pH對出油率的影響

在55 ℃，料液比為1∶5，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶6 000 U，酶解5 h，調(diào)節(jié)pH分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，檢測pH對出油率的影響。由圖4可知，隨著pH值的增加，出油率先增加后降低，在pH3.5出油率最高，達(dá)到48.22%。推測可能是提取液偏酸更有利于果膠酶發(fā)揮酶活力，而pH變化對水解蛋白酶影響不大，故選擇pH為3.5。

2.7 酶解溫度對出油率的影響

在pH 5.5，料液比為1∶5，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶ 6 000 U，酶解5 h，研究溫度對出油率的影響。分別將溫度設(shè)置為35、45、55、65、75 ℃。由圖4可知，55 ℃時(shí)，出油率最高，達(dá)到37.73%，溫度繼續(xù)升高，出油率下降，這可能與酶的最適溫度有關(guān)，果膠酶的適用溫度范圍為40～60 ℃，水解蛋白酶的適用溫度范圍為55～70 ℃。故選擇酶解溫度為55 ℃。

2.8 酶解時(shí)間對出油率的影響

在pH值5.5、溫度55 ℃、料液比為1∶5，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶6 000 U，研究酶解時(shí)間對出油率的影響，設(shè)置酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h。由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，出油率增加，酶解3 h后，增加酶解反應(yīng)時(shí)間，并不能顯著增加出油率。推測酶解3 h基本已催化完全物料中的底物。而且“紙皮”扁桃油含有豐富的不飽和脂肪酸，反應(yīng)時(shí)間延長會(huì)增加油脂的氧化的風(fēng)險(xiǎn)，增加能耗，故選擇酶解時(shí)間為3 h。

2.9 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

2.9.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合顯著性差異分析，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design-Expert 11軟件(Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)，選擇酶解pH(A)、料液比(B)、酶解溫度(C)、酶添加量(D)四個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素設(shè)計(jì)-1、0、1三個(gè)水平，具體因素水平見表1，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以估計(jì)誤差，以出油率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化“紙皮”扁桃油水酶法提取工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 “紙皮”扁桃油水酶法提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

表2 “紙皮”扁桃油水酶法提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 11得到出油率(Y)對自變量酶解pH(A)、料液比(B)、酶解溫度(C)、酶添加量(D)的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=54.80+14.39A+1.79B-7.99C+2.98D-0.332 5AB-7.70AC+1.77AD+5.76BC+0.272 5BD+2.43AD-28.00A2-10.68B2-7.90C2-9.12D2

2.9.2 模型的建立及顯著性分析

由表3還可看出，酶解pH(A)和酶解溫度(C)對響應(yīng)值出油率(Y)的影響極顯著，交互項(xiàng)AC影響顯著，說明酶解pH值和酶解溫度交互作用顯著。

表3 “紙皮”扁桃油水酶法提取工藝響應(yīng)面回歸方程模型方差分析

2.9.3 交互作用分析

響應(yīng)面圖能直接反映各因素與響應(yīng)值的關(guān)系及各個(gè)因素間的交互作用，響應(yīng)曲面坡度越陡、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互作用的影響越大，由圖6可以看出，酶解pH和酶解溫度交互作用對“紙皮”扁桃油水酶法提取出油率影響顯著，隨著酶解pH值的增大和酶解溫度的上升，出油率先上升后下降。

圖6 酶解pH與酶解溫度對油提取率影響的響應(yīng)面

2.9.4 紙皮”扁桃油最佳提取條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的“紙皮”扁桃油水酶法最佳提取工藝參數(shù)為：酶解pH為3.81、料液比為1∶5.135、酶添加量為果膠酶:水解蛋白酶 (237.5 U∶1 187.6 U/g)、酶解溫度為47.59 ℃，在此條件下“紙皮”扁桃的預(yù)測出油率為56.67%。為了驗(yàn)證該結(jié)果的可靠性，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果取平均值，所得“紙皮”扁桃實(shí)際出油率為60.73%。實(shí)際驗(yàn)證值與理論預(yù)測值相比，相對誤差6.68%，表明響應(yīng)面優(yōu)化后的“紙皮”扁桃油水酶法提取工藝可行，具有一定的實(shí)際利用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究利用水酶法提取“紙皮”扁桃油，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，得到水酶法提取“紙皮”扁桃油的最佳工藝參數(shù)為：選取果膠酶和水解蛋白酶，果膠酶和水解蛋白酶添加比例為1∶5(酶活性)、在酶解pH為3.81、料液比為1∶5.135、酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=237.5 U∶1 187.6 U/g、酶解溫度的為47.59 ℃、酶解時(shí)間3 h的條件下，“紙皮”扁桃的出油率可達(dá)60.73%