程 昉 邵亞洲 楊盈盈 劉芯瑩 王婧婧 賈凌云 梁俊玉

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

赤擬谷盜Triboliumcastaneum屬鞘翅目擬步甲科，又稱(chēng)擬谷盜，是一種遍及全世界的重要儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，涉及谷物、油料、中藥材及動(dòng)物性產(chǎn)品等。它食性廣，壽命長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖迅速[1,2]。赤擬谷盜主要為害面粉，其有臭腺分泌臭液，使小麥粉等發(fā)生霉腥味(主要使小麥粉水分上升，黏度、蛋白含量下降)，分泌物還包含致癌物苯醌[3]。幼蟲(chóng)蛀食貯存期的煙葉和茶葉，且導(dǎo)致霉變，也可蛀入糧粒等貯藏物內(nèi)取食，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

長(zhǎng)期、過(guò)量使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑容易造成害蟲(chóng)對(duì)此類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性。同時(shí)多種化學(xué)殺蟲(chóng)劑在使用過(guò)程中有殘留，并通過(guò)食物鏈和生物富集作用進(jìn)入人體，危害人類(lèi)健康[5]。植物源殺蟲(chóng)劑，直接利用或提取植物的根、莖、葉、花、果、種子等或利用其次生代謝物質(zhì)制成具有殺蟲(chóng)作用的活性物質(zhì)[6,7]。相比之下，植物源殺蟲(chóng)劑綠色環(huán)保，且用量低、易降解，對(duì)哺乳動(dòng)物危害小，可作為防治倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)的措施之一[8,9]。近年來(lái)，植物源殺蟲(chóng)劑的研究和開(kāi)發(fā)受到越來(lái)越多的重視，天然植物精油對(duì)部分昆蟲(chóng)和倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)具有驅(qū)避和熏殺作用，可以作為安全低毒的天然驅(qū)避劑和熏殺劑[10-12]。

黃花蒿Artemisiaannua是菊科蒿屬植物，分布于中國(guó)全境，以及歐洲、亞洲的溫帶、寒帶和亞熱帶地區(qū)，生境適應(yīng)性強(qiáng)[13-15]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黃花蒿的研究涉及抗瘧有效成分—青蒿素[16-18]、黃花蒿的抑菌和抗氧化活性[19,20]以及黃花蒿揮發(fā)油的成分分析及活性測(cè)試等。黃花蒿揮發(fā)油主要利用水蒸氣蒸餾法提取，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其化學(xué)成分[21]，而黃花蒿揮發(fā)油主要是對(duì)植物害蟲(chóng)(菜蚜等)進(jìn)行生物活性測(cè)試[22-23]。本實(shí)驗(yàn)研究了黃花蒿揮發(fā)油的化學(xué)成分及其對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的觸殺和驅(qū)避活性，為蒿屬植物揮發(fā)油防治糧食倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和揮發(fā)油提取

黃花蒿于2017年8月采自甘肅省蘭州市安寧區(qū)(海拔1 503 m，東經(jīng)102° 35′ 58″E，北緯35° 34′ 20″N)。將黃花蒿的新鮮葉片切碎，取500 g放入揮發(fā)油提取器中進(jìn)行提取6 h。油水經(jīng)正己烷(分析純)溶劑萃取，無(wú)水硫酸鈉脫水處理后過(guò)濾，減壓濃縮至不含溶劑，得到無(wú)色揮發(fā)油4.5 mL。將揮發(fā)油放至密封容器中并于4 ℃冰箱中保存。

1.2 試蟲(chóng)飼養(yǎng)

將赤擬谷盜飼養(yǎng)在小麥粉和酵母粉比例為10∶1，容積為0.5 L的玻璃瓶中，溫度為(29±1)℃，相對(duì)濕度為70%～80%。待其羽化為成蟲(chóng)1～2周后，取出進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)。對(duì)于幼蟲(chóng)，選擇6日齡幼蟲(chóng)進(jìn)行活性研究。

1.3 揮發(fā)油的GC-MS分析

本實(shí)驗(yàn)采用安捷倫6890 N氣相色譜(FID檢測(cè)器)和安捷倫5973 N型質(zhì)譜聯(lián)用分析揮發(fā)油的化學(xué)組分。實(shí)驗(yàn)中采用的色譜柱為HP-5MS型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序?yàn)?0 ℃開(kāi)始并保持2 min，然后以10 ℃/min速度升到180 ℃并保持1 min，再以20 ℃/min速度升到280 ℃并保持15 min；1 μL樣品(用正己烷稀釋到1%)被注射到氣相色譜儀中，分流比為1∶10；載氣為氦氣，流速為1.0mL/min。通過(guò)與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比來(lái)鑒定揮發(fā)油中每種組分，其相對(duì)百分含量通過(guò)面積歸一法獲得[24]。

1.4 觸殺活性

根據(jù)參考文獻(xiàn)[25,26]的方法測(cè)定黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性。將成蟲(chóng)或幼蟲(chóng)放在培養(yǎng)皿中置于冰袋上，然后用移液槍取0.5 μL樣品的正己烷稀釋液滴于停止行動(dòng)的試蟲(chóng)前胸背板上(幼蟲(chóng)直接滴于其背上)，處理后放入直徑2.5 cm，高5.5 cm的玻璃瓶中。正己烷為空白對(duì)照組，除蟲(chóng)菊素(純度27%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.1%、0.05%、0.025%、0.012 5%)和阿維菌素(純度99.2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%、3%、0.6%、0.12%、0.024%)分別作為成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的陽(yáng)性對(duì)照組，各樣品設(shè)置5個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度(成蟲(chóng)：5.2%、7.9%、11.8%、17.9%、26%、40%；幼蟲(chóng)：5.9%、8.88%、13.3%、20%、30%)，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)5次，每次重復(fù)試蟲(chóng)10頭。處理后置于溫度(29±1)℃，相對(duì)濕度為70%～80%的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，觀察記錄死亡情況，并計(jì)算死亡率與校正死亡率。采用 SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)算半致死劑量LD50(μg/頭)。

死亡率=(死蟲(chóng)數(shù)/試蟲(chóng)數(shù))×100%

校正死亡率=[(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)]×100%

1.5 驅(qū)避實(shí)驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[27,28]方法測(cè)定黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜的驅(qū)避活性。用正己烷溶解揮發(fā)油，將黃花蒿揮發(fā)油制成5個(gè)連續(xù)濃度(0.5%、0.1%、0.02%、0.004%、0.000 8%)梯度的溶液。取與培養(yǎng)皿(直徑9 cm，高1.9 cm)底相同直徑的濾紙，沿中線對(duì)半剪開(kāi)，一半滴加500 μL稀釋溶液，另一半滴加等量正己烷做為空白對(duì)照。等溶劑自然揮發(fā)后，立即用固體膠將處理過(guò)的濾紙相向緊貼在培養(yǎng)皿底部，注意粘牢不留縫隙，以防止試蟲(chóng)鉆到濾紙下面，影響觀察。將20頭試蟲(chóng)從培養(yǎng)皿中央投入，迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋子并密封。不同濃度的樣品同法處理5個(gè)平行樣。同時(shí)以避蚊胺(DEET，純度99%，濃度分別為78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nL/cm2)作為陽(yáng)性對(duì)照。在2、4 h后觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)在不同區(qū)域內(nèi)的試蟲(chóng)數(shù)量，計(jì)算驅(qū)避率。

驅(qū)避率(PR)用下列方程式計(jì)算：

PR=[(Nc-Nt)/(Nc+Nt)]×100%

其中，Nc為出現(xiàn)在陰性對(duì)照區(qū)域的試蟲(chóng)數(shù)量，Nt為出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組區(qū)域的試蟲(chóng)數(shù)量，計(jì)算出PR的平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

校正死亡率的數(shù)據(jù)利用Abbott公式計(jì)算出。采用SPSS V22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)算觸殺的半數(shù)致死量。在驅(qū)避實(shí)驗(yàn)中，斜率和標(biāo)準(zhǔn)誤的值由 Excel 2007軟件計(jì)算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿揮發(fā)油的化學(xué)組分

從黃花蒿揮發(fā)油中鑒定出31種化合物，其主要組分為蒿酮13.2%，β-芹子烯12.3%，樟腦12.2%，桉葉油醇10.3%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃花蒿揮發(fā)油化學(xué)組分及其相對(duì)含量

續(xù)表

據(jù)報(bào)道，江西永修野生黃花蒿花揮發(fā)油的得率為0.98%，其化學(xué)成分主要為桉油精(18.86%)、樟腦(16.55%)、α-愈創(chuàng)木烯(6.82%)、大根香葉烯(6.74%)、石竹烯(5.97%)、順式-乙酸菊花烯酯(5.45%)[29]。河南省黃花蒿采于8月，其揮發(fā)油得率為0.46%，主要成分為蒿酮(46.654%)、桉油精(13.422%)、樟腦(9.648%)[30]。在智亞楠的研究中黃花蒿采于8月，與本實(shí)驗(yàn)樣品幾乎同期，但是其得率遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)黃花蒿。因此推測(cè)，黃花蒿揮發(fā)油含量與其生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)。河南省黃花蒿揮發(fā)油與本實(shí)驗(yàn)的黃花蒿揮發(fā)油的主要成分大致相同，但成分的含量有明顯的差異。江西永修野生黃花蒿揮發(fā)油與本實(shí)驗(yàn)的黃花蒿揮發(fā)油的主要成分相差較大。由此可見(jiàn)，不同產(chǎn)地黃花蒿揮發(fā)油主要成分及含量均有一定的差異，說(shuō)明地域因素對(duì)黃花蒿揮發(fā)油化學(xué)成分有較大的影響。

2.2 觸殺活性

黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的觸殺活性的結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的LD50分別為37.32 μg/頭和70.34 μg/頭。與陽(yáng)性對(duì)照相比，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的LD50是除蟲(chóng)菊素的149.53倍，對(duì)赤擬谷盜幼蟲(chóng)的LD50是阿維菌素的12.33倍。黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的LD50明顯小于對(duì)幼蟲(chóng)的LD50，因此，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的觸殺效果較幼蟲(chóng)的強(qiáng)。

表2 黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的觸殺活性

研究表明，赤擬谷盜幼蟲(chóng)對(duì)揮發(fā)油觸殺作用的敏感性隨日齡的增加而增加：12日齡的赤擬谷盜幼蟲(chóng)對(duì)揮發(fā)油毒性的敏感性要弱于成蟲(chóng)，但是，14～16日齡的赤擬谷盜幼蟲(chóng)對(duì)揮發(fā)油毒性具有與成蟲(chóng)相同的敏感性[31]。這與本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)論相符：黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜幼蟲(chóng)的觸殺效果較成蟲(chóng)的弱。與其他基于相同作用方法的植物源揮發(fā)油的生物活性測(cè)試相比，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的觸殺作用較強(qiáng)。如鞠克升[32]的研究發(fā)現(xiàn)，珠光香青揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的觸殺LD50為41.25 mg/頭；吳彥等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏葉揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)觸殺的LD50為48.59 μg/頭。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜幼蟲(chóng)對(duì)黃花蒿揮發(fā)油的敏感性較成蟲(chóng)弱，這與韓群鑫等[34]的研究發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜對(duì)丁香酚幼蟲(chóng)比成蟲(chóng)更敏感有所不同。

2.3 驅(qū)避活性

黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的驅(qū)避作用見(jiàn)圖1、圖2。由圖1、圖2可見(jiàn)，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)具有一定的驅(qū)避活性。黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)在高劑量(78.63、15.73 nL/cm2)下作用2 h和4 h后的驅(qū)避效果與避蚊胺相似，在0.63 nL/cm2下的驅(qū)避效果均弱于避蚊胺，在0.13 nL/cm2下作用2 h的效果反而強(qiáng)于避蚊胺。在作用2 h后，在5個(gè)測(cè)試濃度下，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜幼蟲(chóng)的驅(qū)避活性低于避蚊胺活性，作用4 h后，在高劑量(78.63、15.73 nL/cm2)下黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜幼蟲(chóng)的驅(qū)避活性高于避蚊胺活性；而在3.15 nL/cm2下，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜幼蟲(chóng)的驅(qū)避活性低于避蚊胺活性。這個(gè)結(jié)果表明，黃花蒿揮發(fā)油與陽(yáng)性對(duì)照避蚊胺對(duì)赤擬谷盜幼蟲(chóng)具有相近的驅(qū)避作用。由此可見(jiàn)，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的驅(qū)避作用比對(duì)幼蟲(chóng)的驅(qū)避作用強(qiáng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò) GC/MS 分析了黃花蒿揮發(fā)油成分及含量，并通過(guò)生物活性篩選發(fā)現(xiàn)黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)均具有良好的觸殺活性和驅(qū)避作用。

雖然黃花蒿揮發(fā)油的作用效果均弱于或相似于陽(yáng)性對(duì)照，但作為糧食倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)防治劑，具有對(duì)有害生物高效、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、易分解、綠色無(wú)污染等特點(diǎn)，且提取方法簡(jiǎn)單，出油率高，資源豐富，在害蟲(chóng)防治中可作為較理想的化學(xué)農(nóng)藥替代品之一。另外，關(guān)于黃花蒿揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜卵的生物活性，對(duì)成蟲(chóng)產(chǎn)卵行為的干擾作用，對(duì)害蟲(chóng)種群的抑制作用以及對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而從根本上解決糧食倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)防治的問(wèn)題。