熊超平 馬 緩,3 朱恩俊 徐煒楓 劉 琴

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院；江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工實驗室；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023) (江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心2，南京 210036) (湖北文理學院理工學院3，襄陽 441025)

為了應對中國農(nóng)業(yè)地理環(huán)境的復雜情況，確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量，越來越多的農(nóng)藥被研發(fā)使用。截至2017年底，已有超過35 000種農(nóng)藥產(chǎn)品注冊，其中有效成分超過665種[1]。為保障食品和環(huán)境安全，人們對田間農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的農(nóng)藥降解動力學一直較為關注[2-5]，此外，對農(nóng)產(chǎn)品在儲藏[6-8]、加工[9-11]過程中農(nóng)藥殘留消解的研究也在持續(xù)開展。小麥是三大谷物之一，小麥的質(zhì)量和產(chǎn)量的穩(wěn)定是糧食安全的重要保障。為了防止小麥在生長期由于真菌的侵染而導致赤霉病和真菌毒素超標，要使用多種抗菌藥物。此外，在糧食儲藏過程中為了防止蟲害的發(fā)生需要施用糧食保護劑。小麥與其他谷物不同，從籽粒到制成直接食用的小麥粉無法通過清洗來去除污染物，因此小麥中農(nóng)藥殘留等危害物的控制必須嚴格的從原糧開始。目前農(nóng)藥在糧食儲藏過程中降解動力學研究大都集中在對少數(shù)儲藏中施用的糧食保護劑如馬拉硫磷等的降解研究[12,13]。而對于田間施用的農(nóng)藥在小麥儲藏過程的變化研究還很少。

本研究選擇了小麥生產(chǎn)和儲藏過程中常用的8種農(nóng)藥(樂果、毒死蜱、氰烯菊酯、氟環(huán)唑、戊唑醇、咪鮮胺、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷)，通過QuEChERS前處理與UPLC-MS/MS檢測相結合的檢測手段，對它們在小麥模擬儲藏過程中的降解動力學進行研究。毒死蜱和樂果是果蔬和糧食生長過程中廣泛使用的有機磷類殺蟲劑，而氰烯菌酯、氟環(huán)唑、戊唑醇和咪鮮胺均為殺菌劑，在小麥生長過程中可以有效抑制赤霉病的發(fā)生[14]，降低禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的嘔吐毒素的累積[15]， 甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷則為糧食在儲藏過程中施用的保護劑[16，17]， 可防止儲糧過程中害蟲入侵所導致的糧食損失，保障儲糧品質(zhì)。研究這些農(nóng)藥殘留在小麥儲藏過程中的變化規(guī)律，可為科學制定小麥中農(nóng)藥殘留標準、指導農(nóng)藥的使用、準確進行谷物中農(nóng)藥殘留的膳食暴露風險評價提供有用的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥樣品來自江蘇省糧食局糧油質(zhì)量監(jiān)測所,收獲于2018年6月。

色譜純乙腈；分散固相萃取鹽包(4 g硫酸鎂、1 g乙酸鈉)；分散固相萃取填料(300 mg硫酸鎂、100 mg N-丙基乙二胺(PSA)、100 mg十八烷基鍵合硅膠(C18))；8種農(nóng)藥標準品(樂果、氰烯菌酯、氟環(huán)唑、戊唑醇、咪鮮胺、甲基毒死蜱、甲基嘧啶膦、毒死蜱)。

1.2 儀器與設備

XW-80A旋渦混合器，Allegra 64R臺式高速冷凍離心機， Xevo TQ液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，F(xiàn)S-Ⅱ型實驗室旋風式粉碎磨。

1.3 實驗方法

1.3.1 小麥樣品的處理

用已配制好的混合標準溶液噴灑小麥，得到農(nóng)藥污染濃度約為5 mg/kg的小麥樣品，放置于通風櫥中過夜后進行儲藏實驗。分別于不同條件下儲藏0、5、14、44、74、104、134、164、194 d取樣，用實驗室旋風式粉碎粉，分別測定小麥中水分及其農(nóng)藥殘留。水分的測定采用國標定溫定時烘干法[18]。

1.3.2 儲藏條件的控制

將飽和硝酸鎂、亞硝酸鈉、氯化鈉飽和鹽溶液分別放入封閉的干燥器中，獲得相對濕度分別為54%、65%、75%的環(huán)境；將小麥樣品放入不同濕度控制的干燥器內(nèi)，并置于溫度25 ℃的恒溫箱中進行模擬同一溫度不同濕度的儲藏條件，在不同溫度下氯化鈉飽和鹽溶液的相對濕度基本保持不變，不同溫度(10、15、25、35 ℃)相同濕度的儲藏條件均用氯化鈉飽和溶液控制。

1.3.3 小麥中農(nóng)藥殘留的測定

1.3.3.1 小麥中農(nóng)藥殘留的提取

采用QuEChERS法提取小麥中的農(nóng)藥殘留[19]。具體如下：準確稱取2.000 g 樣品，加入10 mL蒸餾水振蕩提取2 min，再加入10 mL乙腈振蕩提取2 min后，加入分散固相萃取鹽包振蕩2 min，之后在4 ℃，6 000 r/min下離心5 min。取上清液加入分散固相萃取填料振蕩混合2 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，于-20 ℃儲存待測。

1.3.3.2 8種農(nóng)藥混標的制備

混合標準溶液配制：取1 mg/mL的樂果、氰烯菊酯、氟環(huán)唑、戊唑醇、咪鮮胺、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、毒死蜱各農(nóng)藥標準品，用乙腈稀釋成100 μg/mL的標準混合溶液，于-20 ℃條件下避光保存。

基質(zhì)匹配系列標準工作溶液：取1 mL空白樣品提取液，氮吹干后，用1.0 mL標準混合溶液復溶，得到質(zhì)量濃度分別為20、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL的基質(zhì)匹配標準混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配[20]。

1.3.3.3 儀器條件

液相系統(tǒng)：Waters ACQUITY UPLC；色譜柱：CORTECE UPLC C18(1.6 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃；進樣量：0.1 μL；流動相：A(0.1%甲酸+5 mol/L乙酸銨水)，B(乙腈)；梯度洗脫程序如下:0～0.5 min, 5% B; 0.5～2 min, 5% B～95% B; 2～3 min, 95% B; 3～4 min, 95% B～5% B; 4～5 min, 5% B。

質(zhì)譜系統(tǒng)：Xevo TQ；離子化模式：ESI+；毛細管電壓：3 kV；源溫度：150 ℃；霧化氣溫度：500 ℃；霧化氣流速：0.6 mL/min；錐孔氣流速：10 L/h；優(yōu)化后的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 8種農(nóng)藥的保留時間、監(jiān)測離子及質(zhì)譜采集參數(shù)

1.3.4 檢測方法驗證

采用基質(zhì)空白提取物用于溶劑的校準標準物重構[20]，為消除基質(zhì)效應，采用10倍稀釋因子，對小麥樣品中的8種農(nóng)藥檢測的標準曲線、線性范圍、精密度及四個添加水平(0.5、1.0、5.0 mg/kg)的加標回收率進行測定。

1.3.5 農(nóng)藥降解數(shù)據(jù)分析

不同農(nóng)藥殘留降解活化能(Ea)、指前因子(A)通過Arhenius方程計算得到：

k=Ae-Ea/RT

(1)

式中：A為指前因子；Ea為反應活化能/kJ/mol；T為絕對溫度/K。

2 結果與討論

2.1 農(nóng)藥殘留檢測方法驗證

QuEChERS法是由美國科學家Anastassiades等[22]在2003年提出，最早用于水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留提取，經(jīng)過改進目前已廣泛應用于糧食基質(zhì)，是一種快速簡便的前處理方法。氣相色譜和液相色譜與串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用是同時檢測多農(nóng)藥殘留的常用分析方法。無論是氣質(zhì)還是液質(zhì)聯(lián)用方法都存在基質(zhì)效應，從而影響檢測的準確性。在液質(zhì)聯(lián)用法中，常用基質(zhì)匹配標準溶液校準法、基質(zhì)稀釋、同位素內(nèi)標法等減小基質(zhì)效應的影響[23,24]。本研究通過基質(zhì)匹配標準溶液校準和10倍稀釋消除基制效應。從表2和表3可見，8種農(nóng)藥在小麥中線性檢測范圍為5～2 000 ng/mL，檢出限在0.004～0.211 μg/kg之間。4個加標水平的加標回收率在77.17%～103.00%，檢測精密度為0.74%～10.46%，滿足定量分析技術要求，符合農(nóng)藥殘留檢測的標準。

表2 8種農(nóng)藥的標準工作曲線和檢出限

表3 8種農(nóng)藥在小麥粉基質(zhì)中的加標回收率和精密度

2.2 25 ℃不同濕度模擬儲藏條件下小麥中農(nóng)藥殘留降解動力學

為研究儲藏過程中濕度對農(nóng)藥殘留降解的影響，我們首先在25 ℃下，分別控制相對濕度為54%、65%和75%對小麥進行模擬儲藏，由圖1可以看出，在近六個月的儲藏過程中，氰烯菌酯的濃度幾乎沒有變化。除氰烯菌酯外，其余7種農(nóng)藥隨著儲藏時間的延長而減小圖。表4是根據(jù)一級動力學擬合得到的不同濕度下這7種農(nóng)藥的降解動力學方程、動力學常數(shù)k和半衰期t1/2，由表4可以看出，7種農(nóng)藥lnct～t的線性相關系數(shù)R2在0.91～0.98之間，符合一級降解動力學模型，且在不同儲藏濕度下降解速率常數(shù)相差不大。7種農(nóng)藥在25 ℃下降解的平均速率常數(shù)的大小為：k(戊唑醇)≈k(氟環(huán)唑)

圖1 在25 ℃不同濕度下8種農(nóng)藥的c～t曲線

研究表明,農(nóng)作物生長環(huán)境中的微生物會加速農(nóng)藥殘留降解[25,26]。盡管儲藏濕度會影響到儲糧過程中微生物的生長，但環(huán)境中的微生物種類及活躍程度跟儲藏過程中糧食中微生物的差異較大，我們的結果表明這三個濕度下糧食儲藏微生物對這8種農(nóng)藥殘留的降解影響不大。

2.3 溫度對小麥模擬儲藏條件下農(nóng)藥殘留降解的影響

由圖2可知，在四個溫度下氰烯菌酯的濃度隨儲藏時間的增加無顯著變化，其余7種農(nóng)藥的殘留量c均隨著儲藏時間的增加而減小，且c與t的關系符合一級動力學擬合曲線。

圖2 8種農(nóng)藥在不同儲藏溫度下農(nóng)藥的殘留量c～t的關系曲線

由表5和圖2可以看出，樂果和咪鮮胺降解速率常數(shù)k受溫度的影響較大，樂果在10 ℃的降解速率常數(shù)分別為0.002 4 d-1，在35 ℃下降解速率常數(shù)為0.040 8 d-1，為10 ℃的17倍，它在10 ℃和35 ℃時的半衰期分別為288.8 d和17 d；而咪鮮胺在10 ℃時的降解速率常數(shù)為0.000 7 d-1，半衰期為990.2 d；在35 ℃時的降解速率常數(shù)0.014 d-1，是10 ℃時的20倍，半衰期僅為49.5 d。甲基嘧啶磷和毒死蜱降解則受溫度影響較小，它們在10 ℃時的降解速率常數(shù)分別為0.004 2 d-1和0.002 7 d-1；在35 ℃時的降解速率常數(shù)分別為0.056 d-1和0.0043 d-1，即在溫度升高25 ℃時分別增加了33.3%和59.2%。

表4 7種農(nóng)藥在不同儲藏濕度下的降解動力學方程，降解常數(shù)k(d-1)及半衰期t1/2(d)

表5 7種農(nóng)藥在不同儲藏溫度下的降解動力學方程、速率常數(shù)k、半衰期t1/2、降解活化能Ea和指前因子A

表5還給出了根據(jù)不同溫度下的反應速率常數(shù)計算得到的7種農(nóng)藥的降解活化能(Ea)和指前因子(A)。從表5可以看出，農(nóng)藥降解活化能Ea的大小為：甲基嘧啶磷<毒死蜱<氟環(huán)唑<戊唑醇<甲基毒死蜱<樂果<咪鮮胺?；罨茉礁?，其降解速率常數(shù)隨著溫度的變化越大，如樂果和咪鮮胺；而活化能越低，則其降解速率隨溫度變化越小，如甲基嘧啶磷和毒死蜱，這與它們降解速率常數(shù)隨溫度變化的結果一致。

徐寶正等[27]在甲基嘧啶磷用于糧食的防護實驗中，對立筒倉稻谷儲藏所施用的甲基嘧啶磷的進行定期監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)儲存兩年的稻谷中的甲基嘧啶磷降解了72%～78%，跟我們小麥模擬儲藏中的甲基嘧啶磷的降解速率接近。陳威等[28]報道了稻谷儲藏過程中毒死蜱的降解動力學，在37 ℃時的半衰期為136 d，降解常數(shù)為0.005 d-1，而我們在35 ℃的k為0.004 3，t1/2為161 d，與其報道相吻合。許靜等[29]研究發(fā)現(xiàn)氰烯菌酯在東北黑土降解速率半衰期為97.5 d，而在江西紅土中降解半衰期為330 d，不同土壤中的微生物差別顯著，因此氰烯菌酯在土壤中的降解可能主要是微生物和光降解。顧晨凱等[30]發(fā)現(xiàn)氟環(huán)唑在自然條件下河水中的半衰期為25.6～90.5 d，吳文鑄等[2]則對戊唑醇和氟環(huán)唑在中性水中的降解動力學進行了研究，得出它們的半衰期分別為198 d和131 d，而在不同土壤中的降解半衰期為182～365 d和58.2～72.9 d，即氟環(huán)唑受土壤中的微生物影響可能較大。與環(huán)境中農(nóng)藥殘留降解不一樣，在糧食儲藏過程中一般是避光，且微生物的活性較低、環(huán)境封閉，這會導致成它們的降解動力學比在自然環(huán)境中低，因此更不容忽視。

在2019年農(nóng)業(yè)部等3部門聯(lián)合發(fā)布的國標GB A763—2019中，細化了農(nóng)藥殘留在不同農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量，在小麥籽粒中樂果，氰烯菌酯，氟環(huán)唑，戊唑醇的限量標準為0.05 mg/kg，而甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷的限量較高，為5 mg/kg，毒死蜱為0.5 mg/kg，咪鮮胺為2 mg/kg。小麥與其他的谷物不同，一般在收獲后要儲藏一到兩年才進行制粉，要確保儲藏期間不發(fā)生蟲害，對于降解速率快，毒性小的糧食保護劑，要在儲藏過程中科學的掌握施藥周期，確保施藥效果；而對于儲藏過程中降解速率慢，限量標準低的農(nóng)藥，要根據(jù)它們的降解動力學，嚴格制定其在收獲時的檢出限量。如戊唑醇在20 ℃下其半衰期接近一年，如果常溫下儲藏時間為一年的小麥，則在收獲時檢出限應嚴格控制在0.1mg/kg以下，而氰烯菌酯在收獲時則要嚴格控制在0.05 mg/kg以下。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，8種農(nóng)藥中，氰烯菌酯在小麥模擬儲藏過程中幾乎沒有降解。除氰烯菌酯以外的其他7種農(nóng)藥降解均符合一級動力學降解模型，動力學常數(shù)k均隨溫度升高而增加，但受濕度影響不大。降解活化能最大的是咪鮮胺，其次是樂果，這兩個農(nóng)藥降解常數(shù)受溫度的影響也較大。而降解活化能最小的是甲基嘧啶磷，其受溫度的影響也較小。在25 ℃下除氰烯菌酯外其他7種農(nóng)藥的降解動力學常數(shù)：k(樂果)>k(甲基毒死蜱)>k(咪鮮胺)>k(甲基嘧啶磷)>k(毒死蜱)>k(戊唑醇)≈k(氟環(huán)唑)。樂果降解半衰期(t1/2)最小，約為64 d，而抑菌劑戊唑醇、氟環(huán)唑降解速度最慢，半衰期最長，約為266 d。