張宏聲，陳業(yè)明，華欲飛，孔祥珍，張彩猛，李興飛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

許多食源蛋白，包括乳清蛋白[1]、大豆蛋白[2]、燕麥蛋白[3]和卵蛋白，已經(jīng)被證實(shí)在pH 2和高溫(80～90℃)下可發(fā)生纖維化，并通過靜電作用、范德華力、氫鍵、疏水作用等相互作用形成凝膠。由于其優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，該凝膠可廣泛應(yīng)用于食品(如增稠)和藥品(如生物活性成分的載體)領(lǐng)域。有研究表明，乳清蛋白纖維化后，黏度和凝膠性顯著增強(qiáng)，在食品加工中可以作為良好的凝膠劑和增稠劑[4]。纖維化蛋白可對(duì)功能性成分起到保護(hù)、增溶和遞送等作用[5]。纖維化蛋白還可運(yùn)載抗腫瘤藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向治療，也可以搭載檢測(cè)材料，對(duì)腫瘤做早期診斷[6]。另外，科學(xué)家們已經(jīng)利用纖維化蛋白開發(fā)出新一代生物傳感器[7]。

研究證實(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生纖維化需要一個(gè)前提：蛋白需水解生成多肽產(chǎn)物——纖維化蛋白的組裝單元[8]。Wilson等[9]研究發(fā)現(xiàn)，花生發(fā)芽過程中，內(nèi)源性蛋白酶可水解自身蛋白?；诖耍狙芯繉⑾到y(tǒng)考察未發(fā)芽狀態(tài)下花生內(nèi)源性蛋白酶對(duì)于自身蛋白的水解作用，并考察多肽產(chǎn)物是否可形成纖維化蛋白。同時(shí)，考察蛋白質(zhì)量濃度對(duì)于纖維化蛋白形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

花生，購于山東聊城。濃鹽酸、三羧基氨基甲烷、甲醇、甘油、十二烷基硫酸鈉(SDS)、硫酸鉀、硼酸、無水硫酸銅、濃硫酸，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷鎢酸、抑肽素(Pepstatin A，天冬氨酸蛋白酶抑制劑)，購于Sigma-Aldrich公司。

Himac CR21GⅡ型冷凍離心機(jī)，日本日立公司；MODEL BE-210 型垂直電泳儀，日本BIO CRAFT公司；凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀；MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利安東帕有限公司；Optima XPN型超速離心機(jī)，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司；Jem-2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生蛋白的制備

根據(jù)陳雅靜[10]的方法，稱取50 g花生，加入450 g去離子水，置于冰箱(4℃)浸泡18 h。手工去紅衣后，去離子水清洗3次。去紅衣花生仁中加去離子水至總質(zhì)量300 g，15 000 r/min下打漿2 min，4層紗布過濾除渣，得到花生漿。花生漿通過離心(4℃,7 000 r/min，15 min)可分成上浮Ⅰ、清液Ⅰ和沉淀Ⅰ。離心可使花生漿中的大部分油脂進(jìn)入上?、?，淀粉等顆粒狀成分進(jìn)入沉淀Ⅰ，而蛋白成分主要集中在清液Ⅰ中。

對(duì)清液Ⅰ進(jìn)行超速離心(4℃,50 000 r/min,30 min)，可分成一層薄薄的上?、?清液Ⅰ中的殘留油脂)、清液Ⅱ(清液I中的可溶性糖、離子、游離氨基酸和小肽等成分)和沉淀Ⅱ(主要為花生球蛋白)。沉淀Ⅱ的蛋白質(zhì)含量為50.14%(凱氏定氮法)，為本研究的花生蛋白原料。在沉淀Ⅱ中加入去離子水，配成100、50 g/L和25 g/L的花生蛋白溶液。溶液呈現(xiàn)透明狀態(tài)，說明油脂脫除充分。

1.2.2 pH對(duì)內(nèi)源性蛋白酶水解花生蛋白的影響

將25 g/L蛋白溶液分成6等份，利用1 mol/L鹽酸溶液將其pH分別調(diào)至 7、6、5、4、3、2，并于60℃(本研究室已確定的內(nèi)源性蛋白酶活性的較佳溫度條件)水浴水解4 h，冷卻至室溫，作為Tricine-SDS-PAGE分析的樣品。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE分析

將1.2.2所得樣品的蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為4 mg/mL，并取500 μL加入等體積電泳樣品溶解液攪拌均勻，加入2%二硫蘇糖醇(DTT)攪勻，沸水浴中熱處理5 min，冷卻至室溫即可上樣。

電泳膠的濃縮膠4%，分離膠16%。樣品在進(jìn)入濃縮膠之前電壓為30 V，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)為100 V。電泳指示劑距分離膠前沿0.5 cm時(shí)關(guān)閉電泳儀，進(jìn)行固定、染色、脫色。用凝膠成像儀拍照，Image Lab 4.0.1軟件分析條帶的強(qiáng)度。

1.2.4 花生蛋白纖維化pH條件的初探

將50 g/L蛋白溶液分成6等份，利用1 mol/L或2 mol/L的鹽酸溶液將其pH分別調(diào)至7、6、5、4、3、2，在60℃水浴水解12 h，放入冰水浴，觀察凝膠形成情況。

1.2.5 花生蛋白纖維化與內(nèi)源性蛋白酶之間關(guān)系的確認(rèn)

將100 g/L蛋白溶液分成2等份，一份中加入抑肽素(Pepstatin A)至終濃度為100 μmol/L，另一份作為對(duì)照。用2 mol/L的鹽酸溶液將上述溶液調(diào)節(jié)至pH 3，在60℃水浴熱處理，并在0、6、12 h和24 h時(shí)，取樣置于冰水浴冷卻，隨后置于4℃保存。

利用上述對(duì)照樣品的方法，將50 g/L和25 g/L的蛋白溶液進(jìn)行處理，考察蛋白質(zhì)量濃度對(duì)花生蛋白纖維化的影響。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察

將待測(cè)樣品用pH 3的鹽酸溶液稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為0.25 g/L，同時(shí)將未水解花生蛋白稀釋至蛋白質(zhì)量濃度10 g/L并調(diào)節(jié)pH為3。將稀釋的樣品滴加到專用銅網(wǎng)的碳膜上，盡量攤平，15 s后用濾紙吸去多余的液體，用1 mg/mL的磷鎢酸溶液進(jìn)行處理，15 s后用濾紙?jiān)俅挝ザ嘤嘁后w，放入常溫干燥箱干燥，待樣品干燥后進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察，操作電壓為200 kV。

1.2.7 黏度分析

利用旋轉(zhuǎn)流變儀分析黏度。測(cè)定參數(shù)為：剪切速率變化范圍0.1～100 s-1，測(cè)試過程中記錄剪切應(yīng)力，每10 s記錄一個(gè)點(diǎn)，共計(jì)60個(gè)點(diǎn)。根據(jù)Ostwald-Dewaele方程對(duì)黏度曲線進(jìn)行擬合，按下式計(jì)算蛋白溶液的表觀黏度。

ηa=kγn-1

(1)

式中：ηa為蛋白溶液表觀黏度，Pa·s；γ為剪切速率，s-1；k為黏度系數(shù)；n為流變指數(shù)。n-1 小于0說明體系為假塑性流體(剪切變稀)；k值越大，體系黏度越大。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定3次，使用Excel 2016處理數(shù)據(jù)求平均值，使用Origin8.5擬合曲線和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)內(nèi)源性蛋白酶水解花生蛋白的影響(見圖1)

由圖1可知，制備所得花生蛋白(泳道C的未處理花生蛋白)的主要成分為Ara h 1(66 kDa)和花生球蛋白(42 kDa條帶為球蛋白酸性肽鏈，21 kDa條帶為球蛋白堿性肽鏈)。在pH 2～5的范圍內(nèi)， Ara h 1發(fā)生明顯的降解，尤其是在pH 3。Wilson等[9]發(fā)現(xiàn)花生種子中內(nèi)源性天冬氨酸蛋白酶可有效水解Ara h 1，在pH 2.6～3時(shí)水解活性最強(qiáng)，與本研究相符?；ㄉ虻鞍椎乃嵝噪逆?42 kDa)和堿性肽鏈(21 kDa)在pH 2時(shí)降解最多，但降解程度不大，pH 3時(shí)次之，其他pH不明顯。在pH 3時(shí)，出現(xiàn)了最多的新條帶和強(qiáng)度增強(qiáng)的條帶(箭頭)，是花生蛋白酶解形成的多肽產(chǎn)物，相對(duì)分子質(zhì)量分別為25、19、17、13 kDa和12 kDa。

注：M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；C.未處理花生蛋白；pH 2～pH 7.相應(yīng)pH下60℃水解4 h的花生蛋白溶液。

2.2 花生蛋白纖維化pH條件的初探

按1.2.4方法對(duì)50 g/L花生蛋白溶液進(jìn)行60℃水浴水解12 h及冰水浴處理，結(jié)果顯示，蛋白溶液只能在pH 3條件下形成透明狀的凝膠，這應(yīng)與pH 3時(shí)形成最多的多肽產(chǎn)物相關(guān)。另外，透明狀凝膠的形成基本可說明花生蛋白纖維化的發(fā)生，此結(jié)果將在后續(xù)的研究中進(jìn)行證明。后續(xù)研究將在pH 3和 60℃條件下進(jìn)行。

2.3 花生蛋白纖維化與內(nèi)源性蛋白酶之間關(guān)系的確認(rèn)

首先，利用Tricine-SDS-PAGE考察了抑肽素對(duì)內(nèi)源性蛋白酶水解花生蛋白的影響，結(jié)果如圖2所示。

注：M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。

由圖2可知，抑肽素可明顯抑制Ara h 1和花生球蛋白的水解，但是Ara h 1和花生球蛋白還是發(fā)生了一定程度的水解。這與以下3個(gè)因素相關(guān)：①未被抑肽素抑制的天冬氨酸蛋白酶的水解作用；②其他種類的內(nèi)源性蛋白酶的水解作用；③酸水解作用。對(duì)于第2個(gè)因素，是因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑和巰基蛋白酶抑制劑也具有一定的酶水解抑制作用。圖2顯示，未添加抑肽素的對(duì)照樣品水解形成的多肽產(chǎn)物與圖1相同。結(jié)果說明，在pH 3和60℃條件下，主要是天冬氨酸蛋白酶的水解作用生成多肽產(chǎn)物(25、19、17、13 kDa和12 kDa)，而只有少量的酸水解。該結(jié)論也可由圖1的結(jié)果所支持，因?yàn)閜H 3時(shí)生成的多肽產(chǎn)物很有限和有規(guī)律。而酸水解比較隨機(jī)，多肽產(chǎn)物多種多樣。水解24 h和冰水浴后，添加抑肽素的100 g/L蛋白體系依然呈現(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)，而對(duì)照樣品則是結(jié)實(shí)的透明凝膠狀態(tài)。另外，水解6 h的對(duì)照樣品也形成了結(jié)實(shí)的透明凝膠。

蛋白質(zhì)形成纖維狀結(jié)構(gòu)后，其長徑比將急劇增大。與蛋白質(zhì)聚集體相比，纖維狀結(jié)構(gòu)可更有效地形成物理纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而可急劇增大體系的黏度[11]。因此，本研究通過測(cè)定花生蛋白溶液熱處理過程中的黏度變化，初步確定花生蛋白是否發(fā)生了纖維化，結(jié)果見圖3。

注：反應(yīng)體系為100 g/L蛋白溶液。

由圖3可知，花生蛋白溶液的初始黏度系數(shù)k為0.072，6 h后k增加至28.20。此時(shí)，將花生蛋白體系置于冰水浴冷卻，即可形成透明凝膠。隨時(shí)間延長，蛋白體系的黏度持續(xù)增加，24 h后k為107.54。該結(jié)果明確顯示，蛋白體系黏度發(fā)生了急劇的增大，與Mohammadian[12]、Zhang[13]等的研究結(jié)果相似。圖4為蛋白溶液體系加入抑肽素后體系黏度變化情況。

注：反應(yīng)體系為100 g/L蛋白溶液。

由圖4可知，添加抑肽素的蛋白溶液體系初始黏度系數(shù)k為0.073 3，6 h后k為0.087 2，即使是24 h后，k也僅為0.330 1。以上結(jié)果分析可知：在pH 3和60℃條件下，酸水解作用非常微弱，內(nèi)源性蛋白酶導(dǎo)致的蛋白水解是多肽產(chǎn)物生成的主導(dǎo)因素，與上述推論相符；另外，可初步確定形成的透明凝膠是纖維狀微結(jié)構(gòu)。

2.4 花生蛋白透明凝膠的微觀結(jié)構(gòu)(見圖5)

由圖5可知，未水解的樣品主要是一些球狀的蛋白，大小在10 nm左右，與花生球蛋白尺寸大小相當(dāng)，說明花生球蛋白基本保持原始的球狀結(jié)構(gòu)。水解12 h的蛋白體系中，蛋白組裝形成了長度大于1 μm、直徑小于10 nm的纖維狀結(jié)構(gòu)，纖維之間出現(xiàn)了一些交叉和相互作用。水解24 h的蛋白體系中，纖維狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)增長的趨勢(shì)，并且相互之間交錯(cuò)纏結(jié)。Sasso等[14]制備的乳清蛋白纖維長度在1～10 μm，直徑在2～10 nm的范圍內(nèi)。大豆分離蛋白[15]、菜豆蛋白[16]、酪蛋白[17]和米糠蛋白[13]等自組裝形成纖維的長度與直徑基本都在此范圍內(nèi)。這些結(jié)果明確說明，在pH 3和60℃條件下，內(nèi)源性蛋白酶導(dǎo)致的花生蛋白水解，可形成纖維狀結(jié)構(gòu)的透明凝膠，其結(jié)構(gòu)與pH 2和80～90℃條件下得到的纖維狀結(jié)構(gòu)相似。

注：反應(yīng)體系為100 g/L蛋白溶液；反應(yīng)條件為pH 3和60℃。

2.5 蛋白質(zhì)量濃度對(duì)花生蛋白纖維化的影響(見圖6)

Veerman等[18]認(rèn)為蛋白濃度增大，則意味著組裝單元的濃度增大，從而增大了組裝單元相互作用的概率，有利于蛋白纖維化。

由圖6可知，蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，體系初始黏度系數(shù)k為0.068，6 h后k為14.19，12 h后k為29.73，24 h后k為57.95。12 h的樣品在冰水浴靜置后，可形成透明凝膠。該結(jié)果說明，50 g/L蛋白溶液體系可形成纖維狀結(jié)構(gòu)的凝膠。蛋白質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，體系的初始黏度系數(shù)k為0.086 6，6 h后k為0.087 6，12 h后k為0.088 8，24 h后k為0.089 6。24 h的樣品在冰水浴靜置后，依然呈現(xiàn)液體狀態(tài)，說明25 g/L蛋白溶液體系不能形成纖維狀結(jié)構(gòu)。

注：a.反應(yīng)體系為50 g/L蛋白溶液；b.反應(yīng)體系為25 g/L蛋白溶液；反應(yīng)條件為pH 3和60℃。

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，在pH 3和60℃時(shí)，內(nèi)源性蛋白酶對(duì)花生蛋白的水解作用最強(qiáng)，可生成相對(duì)分子質(zhì)量分別為25、19、17、13 kDa和12 kDa的多肽產(chǎn)物。此時(shí)，起主要水解作用的是天冬氨酸蛋白酶。在蛋白質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，水解6 h后可形成纖維化結(jié)構(gòu)的透明凝膠，水解12 h蛋白纖維的直徑小于10 nm，長度超過1 μm。內(nèi)源性蛋白酶水解花生蛋白對(duì)上述凝膠形成起主導(dǎo)作用，酸水解作用(pH 3、60℃)非常微弱。蛋白質(zhì)量濃度對(duì)于纖維化凝膠形成影響較大，在花生蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L和100 g/L時(shí)可形成凝膠，濃度越大，形成時(shí)間越短；蛋白質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)水解24 h也不能形成凝膠，黏度幾乎不變。