裘芳成,張 濤,常 明,劉睿杰,金青哲,王興國
(江南大學(xué) 食品學(xué)院,食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫 214122)
山茶油被譽為“東方橄欖油”[1],除高油酸外,山茶油還富含各種脂質(zhì)伴隨物[2],其中酚類化合物含量較高,且具有抗氧化、抗炎等多種生理活性[3-4],是山茶油中重要的功能性成分。
植物中酚類化合物可分為游離態(tài)酚類化合物(Free phenolic compound,F(xiàn)P)、酯化酚類化合物(Esterified phenolic compound,EP)、糖苷態(tài)酚類化合物(Glycosylated phenolic compound,GP)及不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物(Insoluble-bound phenolic compound,IBP)4種形態(tài)。目前,國內(nèi)外眾多對果蔬、谷物等酚類化合物的研究已證實不同形態(tài)酚類化合物提取物在含量及生物活性上存在較大差異[5-7],但山茶油中各形態(tài)酚類化合物種類及含量尚未得知。
本研究對山茶油中4種形態(tài)酚類化合物進行提取方法的優(yōu)化,并且通過DPPH、ABTS、FRAC和ORACFL4種方法評價山茶油中4種形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力,以期為山茶油酚類化合物的進一步研究提供參考。
1.1.1 原料與試劑
山茶籽,購自浙江杭州,50℃烘干備用;山茶油,小型家用榨油機壓榨山茶籽,經(jīng)自然沉降過夜分離殘留的餅渣后制得,密封避光保存于-20℃冰箱中備用。
無水甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、抗壞血酸、乙二胺四乙酸、氯化鋁、沒食子酸、Folin酚試劑、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蘆丁、兒茶素、香蘭素、溴化鉀、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、冰乙酸、熒光素鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、2,2′-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、熒光素鈉酸性黃(FL)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),美國 Sigma-Aldrich 公司。
1.1.2 儀器與設(shè)備
UV-2100分光光度計,上海Unico公司;VX-2500型渦旋振蕩器,美國Henry Troemner 有限公司;Centrifuge 5415R高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;AL104型電子分析天平,上海Mettler Toledo儀器有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;XD-5203型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海賢德實驗儀器有限公司。
1.2.1 可溶性酚類化合物提取物的制備
取15 g山茶油,用50 mL正己烷與100 mL 70%甲醇溶液進行提取,室溫下超聲處理30 min后,加入0.04 g/mL氯化鋁溶液對可溶性酚類物質(zhì)進行沉降,并添加20 mL一定濃度的NaHCO3溶液以調(diào)節(jié)pH。靜置,待完全沉淀后過濾,取沉淀物用1.0 mol/L鹽酸溶液溶解,4 000 r/min離心5 min以除去多余沉淀物,用于后續(xù)3個形態(tài)(游離、酯化和糖苷態(tài))可溶性酚類化合物的分級提取。剩余濾液中的正己烷層用于提取不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物。
1.2.2 游離態(tài)酚類化合物的提取
將1.2.1中酸水溶液用乙醚-乙酸乙酯(體積比1∶1)在溶劑與水相體積比為1∶1下提取3次。將有機相合并,加無水硫酸鈉脫除多余水分后,于-20℃下冷凍靜置2 h,過濾除去多余的基質(zhì)共提物。而后將處理過的樣品在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,得到游離態(tài)酚類化合物,用5 mL HPLC級甲醇溶解備用。
1.2.3 酯化酚類化合物的提取
取1.2.2中游離態(tài)酚類化合物提取后的剩余酸水相,按體積比加入一定量含有10 mmol/L EDTA和1%抗壞血酸的4 mol/L NaOH溶液,室溫下在水浴振蕩器150 r/min轉(zhuǎn)速下水解一定時間以釋放酯化酚類。使用6 mol/L HCl將水解產(chǎn)物的pH調(diào)節(jié)至2,然后如1.2.2中對游離態(tài)酚類化合物所述,將釋放的酚類化合物用有機溶劑提取3次,并蒸干復(fù)溶備用。
1.2.4 糖苷態(tài)酚類化合物的提取
取1.2.3中酯化酚類化合物提取后的剩余酸水相,按體積比加入一定量 6 mol/L HCl,在75℃下使用水浴振蕩器在150 r/min轉(zhuǎn)速下水解一定時間以釋放糖基化的酚類,然后如1.2.2中對游離態(tài)酚類化合物所述,將從可溶性糖苷釋放的酚類化合物用有機溶劑提取3次,并蒸干復(fù)溶備用。
1.2.5 不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物的提取
取1.2.1中的正己烷層,加入一定量含有10 mmol/L EDTA和1%抗壞血酸的4 mol/L NaOH,在室溫下使用水浴振蕩器在150 r/min轉(zhuǎn)速下水解一定時間以釋放不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物。使用6 mol/L HCl將水解產(chǎn)物的pH調(diào)節(jié)至2,并在5℃下以4 000 r/min離心5 min。然后,用等體積的正己烷將上清液萃取3次以除去干擾的脂質(zhì),再如1.2.2對于游離態(tài)酚類化合物所述,將釋放的不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物用有機溶劑提取3次,并蒸干復(fù)溶備用。
1.2.6 總酚含量(TPC)的測定
以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用Folin-Ciocalteu比色法測定總酚含量(TPC)??偡雍坑脹]食子酸當(dāng)量GAE表示,具體測定參考Gouvinhas等[8]的方法。
1.2.7 總黃酮含量(TFC)的測定
以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用NaNO2-Al(NO)3比色法測定總黃酮含量(TFC)??傸S酮含量用蘆丁當(dāng)量RE表示,具體測定參考梁杏秋[9]的方法。
1.2.8 縮合單寧含量(CTC)的測定
以(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,采用香草醛比色法測定縮合單寧含量(CTC)。縮合單寧含量用(+)-兒茶素當(dāng)量CE表示,具體測定參考覃宇等[10]的方法。
1.2.9 酚類化合物抗氧化能力測定
采用DPPH、ABTS、FRAP及ORACFL4種方法對山茶油不同形態(tài)酚類化合物進行抗氧化能力比較,其結(jié)果均以Trolox當(dāng)量表示,具體操作參考謝丹[11]的方法。
目前,關(guān)于山茶油酚類化合物的研究多集中在通過有機溶劑可直接萃取的可溶性酚類化合物,而植物中還存在大量與植物基質(zhì)化學(xué)鍵合的結(jié)合態(tài)酚類,需要通過水解等手段破壞化學(xué)鍵后提取[12]。研究表明,堿、酸水解分別能夠有效破壞結(jié)合態(tài)酚類化合物的酯鍵和糖苷鍵,可通過不同水解方法釋放多種形態(tài)的酚類化合物[13]。本實驗借鑒Arruda等[5]對水溶性體系中不同形態(tài)酚類化合物的樣品前處理方法,優(yōu)化了結(jié)合態(tài)酚類化合物提取過程中的水解條件(水解時間、液料比),對山茶油中不同形態(tài)酚類化合物的提取方法進行探索,結(jié)果如圖1~圖3所示。
注:液料比2∶1。
注:水解時間4 h。
由圖1可見:酯化酚類化合物得率隨著水解時間的延長而逐漸增加,在4 h時達(dá)到最高,超過4 h后,酯化酚類化合物得率呈下降趨勢,因此確定最佳水解時間為4 h;在水解時間4 h下,酯化酚類化合物得率隨液料比的增大呈先增加后降低趨勢,在液料比為2∶1時酯化酚類化合物得率最高,因此確定最佳液料比為2∶1。
注:液料比1∶1。
注:水解時間1 h。
注:液料比4∶1。
注:水解時間4 h。
由圖2可見:糖苷態(tài)酚類化合物得率在水解時間為1 h時最高,之后隨水解時間延長呈下降趨勢,因此確定最佳水解時間為1 h;在水解時間1 h下,糖苷態(tài)酚類化合物得率隨液料比的增大呈先增加后降低趨勢,在液料比為1∶1時糖苷態(tài)酚類化合物得率達(dá)到峰值,因此確定最佳液料比為1∶1。
由圖3可見:不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物得率隨著水解時間的延長而逐漸增加,在4 h時達(dá)到最高,因此確定最佳水解時間為4 h;在水解時間4 h下,不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物得率隨液料比的增大呈先增加后降低趨勢,在液料比為4∶1時不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物得率達(dá)到峰值,因此確定最佳液料比為4∶1。
由圖1~圖3可知,隨著水解時間的不斷延長,山茶油中酯化酚類化合物、糖苷態(tài)酚類化合物及不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物得率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。可能的原因是:當(dāng)水解時間較短時,山茶油中結(jié)合態(tài)酚類化合物還未被完全釋放,而隨著水解時間的延長,山茶油中酚類化合物逐漸被釋放,得率上升;當(dāng)水解時間過長時,過堿或過酸的環(huán)境中酚類化合物結(jié)構(gòu)被破壞,從而使得率有所下降。同樣,當(dāng)堿液或酸液的加入量增加時,山茶油中酚類化合物得率也呈先增加后降低的趨勢,這可能是由于當(dāng)堿液或酸液的加入超過一定量時,過堿或過酸環(huán)境下酚類化合物的穩(wěn)定性下降所造成的。
在最佳條件下對山茶油中4種形態(tài)酚類化合物進行提取,并測定了其總酚含量(TPC)、總黃酮含量(TFC)及縮合單寧含量(CTC),結(jié)果如表1所示。
表1 山茶油中提取的4種形態(tài)酚類化合物中TPC、TFC及CTC μg/g
由表1可見,山茶油TPC為225.74 μg/g。其中,酚類化合物主要以糖苷態(tài)存在,占TPC的57.02%,而游離態(tài)酚類化合物的TPC最低,為11.92 μg/g,僅占總含量的5.28%。山茶油TFC為106.67 μg/g,其總體形態(tài)分布趨勢與TPC較為相似。黃酮類化合物主要以糖苷態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)存在,分別占TFC的38.76%和39.52%。而山茶油CTC較低,僅為31.71 μg/g??s合單寧主要以不溶性結(jié)合態(tài)存在,占CTC的49.32%。
已有研究表明,谷物中結(jié)合態(tài)酚類化合物比游離態(tài)酚類化合物具有更強的清除自由基活性[14-15]。本實驗通過DPPH、ABTS、FRAP和ORACFL4種方法,評價山茶油中4種形態(tài)酚類化合物抗氧化能力的差異,結(jié)果如圖4所示。
由圖4可知,山茶油中4種形態(tài)酚類化合物DPPH、ABTS、FRAP和ORACFL4種方法抗氧化能力分別為11.49~101.17、5.53~37.65、2.64~20.68、44.12~184.96 μmol/100 g。4種方法評價的山茶油中4種形態(tài)酚類化合物抗氧化能力的總體趨勢均為糖苷態(tài)酚類化合物>不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物>酯化酚類化合物>游離態(tài)酚類化合物,糖苷態(tài)酚類化合物的抗氧化能力明顯優(yōu)于其他形態(tài)的酚類化合物。
(1)通過單因素實驗優(yōu)化了山茶油中酯化酚類化合物(堿水解法)、糖苷態(tài)酚類化合物(酸水解法)及不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物(堿水解法)提取過程中的水解時間和液料比,結(jié)果表明這3種酚類化合物的最佳水解時間分別為4、1、4 h,最佳液料比(體積比)分別為2∶1、1∶1、4∶1。
(2)利用優(yōu)化的提取方法對山茶油中4種形態(tài)酚類化合物進行提取并測定,其中TPC、TFC及CTC分別為(225.74±0.10)μg/g、(106.67±0.06)μg/g及(31.71±0.23)μg/g。其中,糖苷態(tài)是山茶油酚類化合物的主要存在形式,占TPC的57.02%;山茶油中黃酮類化合物主要以糖苷態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)形式存在,占TFC的38.76%和39.52%;而山茶油酚類化合物提取物中CTC較低,且主要以不溶性結(jié)合態(tài)的形式存在,占CTC的49.32%。
(3)采用DPPH、ABTS、FRAC和ORACFL4種方法對山茶油中4種形態(tài)酚類化合物抗氧化能力進行比較,結(jié)果表明,4種形態(tài)酚類化合物抗氧化能力的強弱順序均為糖苷態(tài)酚類化合物>不溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物>酯化酚類化合物>游離態(tài)酚類化合物。
該結(jié)果為進一步研究山茶油中不同形態(tài)酚類化合物提供了一定的理論基礎(chǔ),為更好地開發(fā)植物油酚類化合物提供一定的參考。