黃愛蘋 章巧琪 谷楨 薛純純 王開強 謝磊

1上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院疼痛科（上海200071）；2上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院寶山分院腎內(nèi)科（上海201999）

神經(jīng)病理性疼痛是由于軀體感覺系統(tǒng)的損傷或疾病所引起的疼痛［1］，以自發(fā)性痛、燒灼樣痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征，在普通人群中的患病率高達7% ～10%，長期的疼痛會嚴重影響生活及情感［2］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)素（brain?derived neu?rotrophic factor，BDNF）參與神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復、再生，影響繼發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持。目前大多研究集中在內(nèi)源性BDNF對神經(jīng)病理性疼痛形成抑制的研究，而對中后期神經(jīng)病理性疼痛的影響報道較少，特別是外源性BDNF。研究證實腺相關(guān)病毒（adeno?associated virus，AAV）介導的外源性BDNF在海馬表達可緩解炎性疼痛及自發(fā)性疼痛［3-4］，在鞘內(nèi)表達可以改善慢性坐骨神經(jīng)壓迫大鼠的疼痛［5］，但鞘內(nèi)表達的鎮(zhèn)痛機制研究未見報道。有研究表明脊髓損傷后BDNF可由抑制逆轉(zhuǎn)上調(diào)鉀離子?氯離子共轉(zhuǎn)運體2（potassium chloride cotransporter 2，KCC2）活性，維持γ?氨基丁酸（γ?aminobutyric acid，GABA）功能而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛［6］。因此，本研究通過鞘內(nèi)注射AAV介導的BDNF于脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）大鼠，觀察注射前后SNL大鼠痛閾值變化及注射后BDNF、KCC2在脊髓背角的表達情況，探討AAV介導的BDNF對神經(jīng)病理性疼痛的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選取體質(zhì)量200 ～250 g雄性SD大鼠56只，由上海西普爾?必凱實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018?0006。隨機分7組，每組8只，分別為正常組、SNL組、SNL+生理鹽水組（NS）、SNL+空載組（AAV0）、SNL+AAV?BDNF組（BDNF）、SNL+AAV?BDNF+KCC2拮抗劑組（BDNF+Furos）、SNL+AAV?BDNF+NS組（BDNF+NS）。

1.2 主要試劑及儀器BDNF抗體（ab203573，Abcam，USA），KCC2抗體（ab134300，Abcam，USA），Westorn?blot鼠二抗（M21001F，abmart，USA），BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010，碧云天），蛋白marker（10?250KD）（26619?1，F(xiàn)ermentas，CAN），ECL發(fā)光液（OH188466A，Thermo，USA），足底觸覺測定儀（IITC，USA），足底熱痛敏測定儀（Ugo Basile，ITA），切片機（MR2076，Leica，DEU），全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon?4200，Tanon），GEL im?age system（Tanon?1000，Tanon）。

1.3 AAV 載體的構(gòu)建帶有BDNF的基因片段的質(zhì)粒PCR擴增回收，正向引物：5′?tccatagaagacacc?gggatccgccaccATGTCTGACCCCAGTGCCTG?3′，反向引物：5′?atccttgtagtcgttaattaaggtaccTCTTCCCCTTTT?AATGGTCA?3′。擴增后與載體pHBAAV?CMV?MCS?3flag?T2A?ZsGreen（購自Hanbio Biotechnology）酶切后進行連接反應，轉(zhuǎn)化、挑菌、PCR鑒定測序。將制備的pHBAAV2/9?BDNF?GFP及其輔助包裝載體質(zhì)粒pAAV?RC、pHelper，分別進行高純度抽提，共轉(zhuǎn)染AAV?293細胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，72 h后收集富含腺相關(guān)病毒顆粒的AAV?293細胞。反復凍融裂解細胞，收集上清液，利用全能核酸酶處理和柱純化方法，得到高滴度的純化腺相關(guān)病毒顆粒HBAAV2/9?BDNF?GFP，熒光定量PCR法測定滴度。

1.4 SNL 模型建立以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，以L5/6棘突間隙為中心做一長約4 cm縱向切口，逐層分離至椎板、關(guān)節(jié)突，咬除左側(cè)L5椎板和關(guān)節(jié)突，暴露分離左側(cè)L5脊神經(jīng)并結(jié)扎。充分沖洗止血，逐層縫合，肌注青霉素預防感染。造模后48 h測機械痛低于造模前30%為造模成功。

1.5 鞘內(nèi)注射造模成功48 h后，大鼠3%異氟烷吸入麻醉，一手定位L5/6棘突間隙，16G粗針破皮，另一手持微量注射器，按Mestre報道的方法刺入蛛網(wǎng)膜下腔，穿刺成功可見典型鼠尾甩動。相應試劑于10 s內(nèi)推完。異氟烷吸入停止后動物在1 min內(nèi)恢復翻正反射。NS、AAV0、BDNF、BDNF+Furos、BDNF+NS各組分別注射NS 10 μL、AAV0（1×1010）10 μL、AAV?BDNF（1×1010）10 μL、AAV?BDNF（1 × 1010）10 μL+KCC2拮抗劑15 μg、AAV?BDNF（1×1010）10 μL+NS 15 μg。

1.6 機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）、熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）測定注射前后各時間點上午8：00～11：00，分別測定患側(cè)足底MWT、TWL值。Von Frey測定法測定MWT（足底觸覺測定儀最大碰觸力50 g），熱平板法測定TWL（熱源的強度設定為75%，時間上限30 s）。連續(xù)測3次，每次間隔5 min，取其平均值。

1.7 取材及Westom blot 檢測行為測試后，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，開胸，通過心臟用生理鹽水、4%多聚甲醛磷酸緩沖液灌注固定。取L4?L6脊髓腰膨大入4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定30 min（4 ℃），-80 ℃低溫冰箱保存。取適量組織液氮研磨，冰上裂解1 h，4 ℃離心取上清加入5× Loading Buffer，100 ℃煮沸10 min，離心后電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，稀釋后一抗4 ℃孵育過夜，洗膜3次，室溫稀釋二抗孵育1 h，洗膜3次，于保鮮膜上ECL底物反應液反應60 s，瀝干，曝光成像。

1.8 統(tǒng)計學方法本實驗采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。行為學數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，使用單因素方差分析，方差齊者兩兩比較采用t檢驗。Western?blot實驗結(jié)果用Image?Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計分析；應用Graph Pad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)圖制作。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠注射前后MWT、TWL 比較觀察發(fā)現(xiàn)造模前各組大鼠基礎MWT、TWL值無明顯差異。注射后各組MWT、TWL逐漸降低，至注射后7 d，SNL、NS、AAV0各組趨于穩(wěn)定，BDNF、BDNF+Furos、BDNF+NS各組逐漸回升，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.001）。注射后14、21 d，BDNF組MWT、TWL高于SNL、NS、AAV0各組（P ＜0.001）。BDNF+Furos組注射后各時間點MWT、TWL均低于BDNF、BDNF+NS組（P ＜0.001）。注射前后相應時間點SNL、NS、AAV0各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1、2。

表1 鞘內(nèi)注射前后大鼠機械縮足反射閾值Tab.1 MWT in rats before and after intrathecal injection ±s

表1 鞘內(nèi)注射前后大鼠機械縮足反射閾值Tab.1 MWT in rats before and after intrathecal injection ±s

注：與正常組比較，*P ＜0.001；與SNL、NS、AAV0 組比較，#P ＜0.001；與BDNF、BDNF+NS 組比較，δP ＜0.001

分組正常SNL NS AAV0 BDNF BDNF+Furos BDNF+NS注射前2 d 35.49±3.88 37.11±3.13 36.62±2.69 35.47±2.36 36.10±2.42 34.69±2.14 36.07±1.86 0 37.73±1.80 25.49±2.69*25.05±2.47*22.57±2.07*23.82±1.87*23.48±2.53*24.10±1.20*3 d 36.39±3.23 22.04±2.41*19.76±1.55*20.11±2.87*20.70±3.63*10.18±1.15*δ 20.98±3.17*7 d 36.41±1.97 17.47±2.17*17.76±2.73*19.32±1.25*20.52±3.14*11.03±1.54*δ 20.69±3.07*14 d 36.99±3.05 16.08±2.58*15.61±1.45*17.02±2.15*22.99±2.81*#17.99±1.77*δ 22.30±3.06*21 d 36.00±2.50 16.49±1.52*18.01±2.83*17.64±2.19*27.41±2.68*#21.31±3.32*δ 27.13±2.20*

表2 鞘內(nèi)注射前后大鼠熱縮足反射潛伏期Tab.2 TWL in rats before and after intrathecal injection ±s

表2 鞘內(nèi)注射前后大鼠熱縮足反射潛伏期Tab.2 TWL in rats before and after intrathecal injection ±s

注：與正常組比較，*P ＜0.001；與SNL、NS、AAV0 組比較，#P ＜0.001。與BDNF、BDNF+NS 組比較，δP ＜0.001

分組正常SNL NS AAV0 BDNF BDNF+Furos BDNF+NS注射前2 d 24.81±1.90 25.02±2.49 24.92±2.25 24.36±2.91 24.11±1.74 24.84±2.49 23.83±1.74 0 24.69±2.87 16.92±2.65*15.42±1.41*17.74±3.39*16.10±2.53*15.61±2.10*16.97±2.61*3 d 26.05±1.38 13.53±1.53*13.34±3.90*14.64±3.97*12.88±2.53*6.35±1.32*δ 13.09±2.38*7 d 24.47±2.86 9.10±2.64*9.18±1.43*10.69±1.36*10.85±2.00*6.87±1.40*δ 11.41±0.89*14 d 25.76±1.60 7.92±2.23*8.34±3.11*9.1±1.44*13.66±2.43*#7.95±1.09*δ 14.24±2.39*21 d 24.80±2.36 9.29±2.64*8.79±1.05*9.67±1.03*16.21±1.87*#7.82±0.82*δ 15.73±1.18*

2.2 注射后21 d 脊髓背角BDNF、KCC2 蛋白的表達情況正常組與SNL組比較，BDNF蛋白表達無明顯差異；BDNF組與正常組、SNL、NS、AAV0組相比，BDNF表達顯著升高（P ＜0.001）；BDNF+Furos組與BDNF、BDNF+NS組比較差異無統(tǒng)計學意義（圖1A）。造模各組與正常組比較，KCC2蛋白表達明顯下降（P ＜0.001）；與SNL、NS、AAV0相比，BDNF組KCC2表達明顯升高（P ＜0.001）；與BDNF、BDNF+NS組比較，BDNF+Furos組KCC2表達顯著下降（P ＜0.001，圖1B）。

3 討論

BDNF在正常狀態(tài)下，神經(jīng)元細胞、肌肉、施旺細胞等可合成分泌一定量的BDNF，以維持神經(jīng)元的存活和功能。當神經(jīng)損傷時，BDNF參與了損傷神經(jīng)的修復與保護［7］。IKEDA等［8］發(fā)現(xiàn)急性脊髓損傷后內(nèi)源性BDNF在不同細胞內(nèi)表達增加（包括運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等），參與神經(jīng)的修復，但表達量有限。本研究鞘內(nèi)注射后21 d發(fā)現(xiàn)SNL組與正常組脊髓背角BDNF表達無明顯差異，表明損傷后內(nèi)源性BDNF表達有限，不能滿足神經(jīng)的修復保護。如果給予一定量的外源性BDNF是一種較好的途徑。有研究證實通過椎管內(nèi)給予外源性BDNF［9］、或慢病毒緩慢釋放［10］、BDNF轉(zhuǎn)基因小鼠過表達［11］都可促進軸突的再生、神經(jīng)的修復。

圖1 鞘內(nèi)注射21 d 后脊髓背角內(nèi)BDNF、KCC2 蛋白的表達Fig.1 Expression of BDNF and KCC2 protein in spinal dorsal horn at 21 d after intrathecal injection

神經(jīng)的損傷伴隨神經(jīng)病理痛的發(fā)生。多項研究表明，BDNF參與了神經(jīng)病理痛的形成和維持。M′DAHOMA等［12］發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射BDNF誘發(fā)的痛覺過敏和超敏反應與坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷引起的疼痛類似，可被BDNF?TrkB受體拮抗劑所阻止。CONSTANDIL等［13］也發(fā)現(xiàn)正常大鼠鞘內(nèi)注射外源性BDNF可引起痛覺過敏，但無劑量依賴性、疊加性。UCHIDA等［14］通過部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型鞘內(nèi)注射抗BDNF抗體，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2 d注射鎮(zhèn)痛效果最佳，4 d后注射療效甚微，表明內(nèi)源性BDNF在神經(jīng)病理痛形成初期起了重要作用。而在疼痛發(fā)生的中后期，卻有研究發(fā)現(xiàn)BDNF可減輕疼痛。MA等［4］報道AAV介導的BDNF在海馬內(nèi)的過表可緩解自發(fā)性疼痛，LIANG等［15］研究BDNF的過表達可以減輕脊髓損傷的炎癥反應，從而降低炎性疼痛。糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠通過內(nèi)源性或外源性BDNF增加，可以降低GRD神經(jīng)元和K+離子通道興奮性，以緩解疼痛癥狀［16-17］。

可以看出，BDNF有修復、保護神經(jīng)及止痛、致痛等多重作用，這可能與BDNF表達的時間與不同部位有關(guān)，即初期為疼痛的啟動因子，中后期更側(cè)重于修復鎮(zhèn)痛，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，本研究通過AAV介導的BDNF鞘內(nèi)注射SNL大鼠與對照組、空白組比較，發(fā)現(xiàn)2周后大鼠機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期逐漸升高，鞘內(nèi)注射21 d時病毒載體穩(wěn)定表達外源性BDNF，表明椎管內(nèi)緩慢釋放外源性BDNF可以減輕異常性疼痛和神經(jīng)痛的痛覺過敏，與以往報道一致［5］。

GABA抑制功能的下降是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的關(guān)鍵因素。其中抑制性中間神經(jīng)元受體以GABAA為主。GABAA受體激活后開啟突觸后膜上的氯離子通道，使氯離子按照電?化學規(guī)律快速流入細胞，引起突觸后膜電位改變，從而形成抑制性效應。研究表明中樞抑制性功能（GABA）下調(diào)可引發(fā)自發(fā)性疼痛和痛覺過敏［18-19］。KCC2是陽離子?氯離子共轉(zhuǎn)運體家族中重要的一員，其能將細胞內(nèi)氯離子泵出細胞外，造成胞外高氯，從而維持GABAA受體的抑制性功能［20］。神經(jīng)損傷初期，BDNF激活TrkB通過級聯(lián)反應引起去磷酸化，細胞表面KCC2降解，導致KCC2活性下降，使抑制性神經(jīng)元的功能低下，產(chǎn)生致痛作用［21］，表明BDNF在脊髓神經(jīng)損傷早期是神經(jīng)病理痛啟動因子之一。而當損傷進入亞急性期或慢性期，為了應對損傷，BDNF反而促進了KCC2表達上調(diào)，此作用可以被TrkB?Fc所阻止，同時損傷2周后注射外源性BDNF也可以上調(diào)KCC2的mRNA表達［22-23］。HUANG等［6］表明外源性BDNF由未損傷時的抑制逆轉(zhuǎn)為脊髓損傷后上調(diào)KCC2表達、恢復GABA激動劑的抑制作用產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。本研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射21 d BDNF組脊髓背角KCC2表達上調(diào)，而當鞘內(nèi)同時注射KCC2抑制劑呋塞米后，BDNF+Furos組脊髓背角KCC2表達下調(diào)，痛域值顯著下降，說明損傷后期外源性BDNF的表達產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用與KCC2的表達上調(diào)有關(guān)，而且此作用可以被KCC2抑制劑所阻止。這可能通過增加KCC2表達活性以維持細胞外高氯，進而維持GABAA受體的抑制性功能實現(xiàn)鎮(zhèn)痛。而BDNF是否影響GABA表達產(chǎn)生鎮(zhèn)痛需要進一步證實。

綜上，攜帶BDNF基因的AVV病毒鞘內(nèi)緩慢的表達外源性BDNF可以起到鎮(zhèn)痛作用，這與KCC2上調(diào)有關(guān)。然而BDNF的作用機制復雜，在致痛、止痛、修復保護神經(jīng)及神經(jīng)再生都有表現(xiàn)，相關(guān)通路多為共用，這些功能的轉(zhuǎn)變尚不清楚，需要進一步研究解決。而如何控制基因表達及控制有效表達的問題仍需克服，過度表達是否會對無損傷神經(jīng)產(chǎn)生影響則需進一步證實。