朱亞琴 金雪 趙偉

【摘 要】目的：探索濁毒清對胰島素胰島β細胞功能保護的藥物篩選和藥效。方法：利用貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院的300種濁毒清，按照25、50、100ug/ml的濃度分別作用于胚胎，觀察斑馬魚胰島β細胞恢復及再生的熒光表達情況，并進一步在細胞水平和功能實驗證實。結(jié)果：篩選出胰島β細胞有再生作用的濁毒清，之后用于臨床糖尿病患者血糖、胰島功能研究觀察，探索開發(fā)具有糖尿病胰島β細胞保護和再生的濁毒清。結(jié)論：濁毒清由佩蘭、黃連、茯苓、陳皮、水蛭、苦杏仁、薏苡仁、白豆蔻、甘草等組成。從中篩選的濁毒清對臨床糖尿病患者服用后血糖和胰島功能均有所改善。

【關鍵詞】濁毒清;胰島β細胞;藥物篩選;藥效研究

【中圖分類號】R28 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2020）12--01

引言：隨著我國人民群眾生活水平不斷提高，糖尿病及其并發(fā)癥患者日益增多，因糖尿病致死的病患者在所有致死疾病中，位列第三，糖尿病人類健康的威脅迫使人們對其不得不引起極大重視。當前世界各國都投入巨大人力和物力研究和開發(fā)解決糖尿病問題的藥物。在我國，中國傳統(tǒng)醫(yī)藥為我們研究和開發(fā)治療糖尿病藥物，提供了海量的資源寶庫。近十余年來，我國濁毒清在防治糖尿病慢性并發(fā)癥方面做了大量的臨床和實驗研究，出現(xiàn)了可喜的成果，不論是單品濁毒清還是復方濁毒清，其有效成分都由對胰島素中的胰島β細胞起到促進再生速度和保護作用，因此如何在實驗上通過建立胰島β細胞破壞模型，進行高通量藥物篩選，尋找能對胰島β細胞保護和再生的濁毒清藥物，具有很重要研究價值和開發(fā)意義。

1 實驗動物

斑馬魚因其具有能承受高密度飼養(yǎng)，胚胎發(fā)育快，有高度保守的疾病信號轉(zhuǎn)導能力，有獨特的生物學、基因組學和遺傳學等先天優(yōu)勢，因此特地選用其作為本次實驗動物。實驗試圖在斑馬魚體內(nèi)胰島β細胞破壞模型，用于篩選出治療糖尿病的藥物。

利用胰島素-硝基還原酶-綠色熒光蛋白（insulin-nfsB–green fluorescent protein; INS-nfsB-GFP）轉(zhuǎn)基因系F1/F2代胚胎分為A組（正常對照組），按照胚胎受精時間不同分為3個實驗分析對比組別，

B組選用的是胚胎受精后24H，

C組選用的是胚胎受精后36H，

D組選用的是胚胎受精后48H，然后再分別在不同毫摩爾（mmol/L）濃度（5 mmol/L， 7.5 mmol/L， 10 mmol/L， 15 mmol/L）的甲硝唑中孵育24～48 h。

2 飼養(yǎng)條件

魚房溫度控制在28.5℃左右，保持通風，水PH值在7.4左右。

3 藥物制備

實驗采用的濁毒清由佩蘭、黃連、茯苓、陳皮、水蛭、苦杏仁、薏苡仁、白豆蔻、甘草等組成。貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院的300種濁毒清樣本，按照25、50、100ug/ml的濃度稀釋。

4 實驗分組

A組：自然對斑馬魚胚胎未加入濁毒清進行孵育。

B組：按照25ug/ml的濃度稀釋的濁毒清處理

C組：按照50ug/ml的濃度稀釋的濁毒清處理

D組：按照100ug/ml的濃度稀釋的濁毒清處理

5 實驗過程：

實驗總體方向：通過利用體式倒置熒光顯微鏡觀察斑馬魚胰島素中的胰島β細胞破壞及熒光表達的情況，進而又運用原位雜交方法進一步在分子水平證實實驗。具體步驟：首先進行轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，然后進行挑克隆、質(zhì)粒DNA提取、裂解細胞，以及對細胞進行提取和純化，洗脫質(zhì)粒DNA，酶切insulin質(zhì)粒鑒定、配制酶切反應體系等一系列的實驗過程。具體過程以及操作方法嚴格按照實驗室要求展開。

6 運用原位雜交方法證實過程：

首先要提取斑馬魚胚胎，從胚胎盤中去除無法存活的斑馬魚胚胎，通過對胚胎進行去膜處理，多次（5～6次）清洗后把它移入含Ptu的 E3 溶液中，讓胚胎繼續(xù)生長發(fā)育。

其次是對胚胎進行固定;將所需不同時間點的胚胎轉(zhuǎn)移入裝有1-1.5 ml的 4% Paraformaldehyde/PBST固定液的1.5-2ml 小管中， 4℃旋轉(zhuǎn)過夜。在轉(zhuǎn)移過程中盡量不要帶入過多的E3 溶液，以免影響固定液的濃度。

再次對固定小管中的胚胎進行洗滌，洗滌方法如下：

首先讓胚胎在室溫下通過搖床上輕微晃動，輕微晃動是指保證搖動時水動而胚胎不動。然后通過甲醇脫水，最后將胚胎在室溫狀態(tài)下，將不同濃度（75%，50%，25%）的胚胎各自進行輕微晃動10 min;在100% Methanol中， 室溫下?lián)u床上輕微晃動10 min，兩次。處理完畢后保存于Methanol中的胚胎可長期存放-20℃。

第一天;將保存于-20℃中的胚胎取出， 在室溫狀態(tài)下，將不同濃度（75%，50%，25%）的胚胎各自進行輕微晃動5-10 min;

6-10天后，把繼續(xù)生長的胚胎，放入100ug/ml的ProK/PBST中， 室溫下?lián)u床上輕搖30 min.

7 用體式熒光顯微鏡觀察胰島β細胞熒光的表達情況

形態(tài)學觀察 通過利用體式倒置熒光顯微鏡和共焦顯微鏡兩種實驗設備觀察斑馬魚胰島β細胞破壞及熒光表達的情況，實驗結(jié)果如圖1

8 統(tǒng)計學分析

通過選取貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院132名患者糖尿病患者臨床觀察：患者未服用濁毒清68名和患者服用濁毒清治療血糖64名觀察對比情況。

在統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±均數(shù)標準差（）表示，自身前后比較用t檢驗，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

討論：糖尿病人使用胰島素，會出現(xiàn)低血糖反應，有的出現(xiàn)水腫，皮膚出現(xiàn)淤青，過敏，也有的出現(xiàn)營養(yǎng)不良，屈光不正等情形。濁毒清等中醫(yī)藥中含有抑制胰島素β細胞分泌因子，因此在控制血糖含量，提高患者體內(nèi)胰島素水平，增加胰島β細胞靈活度，改善患者抗病能力，進而可以有效降低糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生。[1]從實驗結(jié)果得出，不同濁毒清對胰島β細胞有再生作用均有不同，因此，要從單品濁毒清中篩選具有顯著療效的濁毒清，必須在臨床和實驗的基礎上，加大對其藥效分析。由佩蘭、黃連、茯苓、陳皮、水蛭、苦杏仁、薏苡仁、白豆蔻、甘草等組成濁毒清，其中單品濁毒清含有有效成分丹參、黃芪、大黃（素）、川芎等復方濁毒清則有加味核桃承氣湯、八味地黃丸等，不論是單品還是復方，由于組方合理，配方科學，藥品成分復雜，對糖尿病胰島β細胞良好的抑制作用，同時對患者血清改善，通過促進患者體內(nèi)自身免疫，避免胰島素不足或胰島素抵抗力低下。此外，濁毒清由于基于中醫(yī)調(diào)節(jié)人體陰陽和諧理念，對人體無毒副作用，在治療糖尿病上有很高的安全可靠性。[2]因此，利用濁毒清的功效，制造出胰島β細胞保護類藥物，在開發(fā)和市場上都有很廣闊的發(fā)展前景，隨著先進技術不斷升級，從單品濁毒清及復方濁毒清中篩選出可靠和穩(wěn)定新型糖尿病治療藥物不再是夢想。[3]

結(jié)論：從中篩選的濁毒清對臨床糖尿病患者服用后血糖和胰島功能均有所改善。

參考文獻：

李萍.中醫(yī)藥改善2型糖尿病患者胰島β細胞功能研究進展[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2019，33（4）：155-158.

孫穎，劉紅利，崔雯雯， 等.中藥對胰島β細胞的保護機制研究概述[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（18）：215-219.

左運葉.兩種常用降糖藥對新診斷2型糖尿病患者胰島β細胞功能的保護效能研究[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2020，7（2）：9-10.

李珊珊，孔德明，秦帥， 等.可示蹤轉(zhuǎn)基因斑馬魚胰島β細胞破壞和再生模型分析[J].基因組學與應用生物學，2016，35（10）：2647-2652.