石喆 任珊 戴文斌

[摘要] 目的 探討乳腺良惡性病變中人乳頭狀瘤病毒（HPV）16/18型感染和Rb蛋白的表達(dá)狀態(tài)及其相關(guān)性。方法 收集2016年1月—2017年12月廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院乳腺外科乳腺手術(shù)切除標(biāo)本為研究對(duì)象，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（IDC）68例為IDC組、乳腺不典型導(dǎo)管上皮增生（ADH）30例為ADH組、乳腺纖維腺瘤旁正常乳腺組織30例為正常乳腺組。原位雜交法檢測(cè)HPV16/18 DNA，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Rb蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 IDC組中HPV16/18 DNA陽(yáng)性率高于正常乳腺組和ADH組;Rb蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于正常乳腺組和ADH組（均P < 0.05）。三組HPV16/18 DNA感染與Rb蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)性（r = -0.802、-0.774、-0.802，均P < 0.05）。IDC患者HPV16/18DNA、Rb蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期密切相關(guān)（P < 0.01）。 結(jié)論 HPV16/18型感染和Rb蛋白的表達(dá)缺失可能涉及人乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 乳腺腫瘤;人乳頭狀瘤病毒16;人乳頭狀瘤病毒18;Rb蛋白;原位雜交;免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R737.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）10（b）-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of human papilloma virus （HPV）16/18 and Rb protein in benign and malignant breast lesions and its correlation. Methods From January 2016 to December 2017， the surgical breast surgically resected specimens in Liuzhou People′s Hospital of Guangxi Zhuang Artonomous Region as the research object， 68 cases with invasive ductal carcinoma （IDC） of IDC group， 30 cases with breast atypical ductal epithelial hyperplasia （ADH） of ADH group， 30 cases with normal breast tissue adjacent to breast fibroadenoma of normal breast group. HPV16/18 DNA was detected by in situ hybridization and Rb protein was detected by immunohistochemistry. Results HPV16/18 DNA positive rate in IDC group was higher than that in normal breast group and ADH group; the positive Rb protein expression rate was lower than that in normal breast group and ADH group（all P < 0.01）. The expression of HPV16/18 DNA in each group was negatively correlated with the expression of Rb protein （r = -0.802， -0.774， -0.802， all P < 0.05）. The expression of HPV16/18 DNA and Rb protein in IDC patients was closely related to histological grade， lymph node metastasis and pTNM stage（P < 0.01）. Conclusion The HPV16/18 infection and Rb protein expression deletion may be involved in the occurrence and development of breast cancer.

[Key words] Breast neoplasms; Human papillomavirus 16; Human papillomaviru 18; Rb protein; In situ hybridization; Immunohistochemistry

乳腺癌是當(dāng)今女性最常見的惡性腫瘤[1]，人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染與乳腺癌病因?qū)W之間的關(guān)系已引起人們的關(guān)注[2]。研究報(bào)道[3]，大約29.0%的女性乳腺癌組織中高危型HPV陽(yáng)性，特別是HPV16、18或33亞型。本研究采用分子原位雜交（In situ hybridization，ISH）和免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）染色技術(shù)，檢測(cè)正常乳腺、乳腺不典型導(dǎo)管上皮增生（ADH）和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（IDC）組織中HPV16/18 DNA和Rb蛋白表達(dá)，探討HPV16/18型在乳腺癌中的感染頻率和Rb蛋白的表達(dá)狀態(tài)及其與臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月—2017年12月廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院乳腺外科女性乳腺手術(shù)切除標(biāo)本，其中IDC 68例為IDC組，ADH 30例為ADH組，乳腺纖維腺瘤旁正常乳腺組織30例為正常乳腺組。IDC組年齡26～75歲，平均（49.48±10.51）歲;病理診斷參照2012年WHO乳腺腫瘤分類[4-5]進(jìn)行，其中Ⅰ級(jí)7例、Ⅱ級(jí)51例、Ⅲ級(jí)10例;pTNM分期：Ⅰ期23例、Ⅱ期30例、Ⅲ期15例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。ADH組年齡34～74歲，平均（50.75±10.70）歲。正常組年齡35～70歲，平均（49.09±9.75）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次診斷乳腺癌;②臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)放化療及內(nèi)分泌治療等抗腫瘤手段治療者;②合并其他部位惡性腫瘤者。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有檢測(cè)方法均獲得患者知情同意。三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有標(biāo)本為術(shù)中冰凍送檢組織，經(jīng)冰凍切片確診后即選取組織常規(guī)固定，脫水，包埋。入選病例蠟塊均做4 μm連續(xù)切片分別做蘇木精-伊紅染色、ISH和IHC檢測(cè)。

1.2.1 IHC染色? 采用EnVison兩步法。即用型單克隆抗體Rb（MS-107-R7）購(gòu)于Thermo公司，EnVison檢測(cè)試劑盒（GK500710）購(gòu)于基因科技（上海）有限公司。切片需做EDTA pH8.0抗原微波修復(fù)處理，操作步驟按說(shuō)明進(jìn)行。用已知乳腺癌Rb蛋白陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液（PBS）取代一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2 ISH? 行地高辛標(biāo)記ISH檢測(cè)。HPV16/18 DNA探針和原位雜交試劑盒（ISH-5126）購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用已知宮頸癌HPV16/18 DNA陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS替代探針作陰性對(duì)照。

1.3 疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)

病理醫(yī)師雙盲法閱片，取平均值計(jì)算閱片結(jié)果。ISH以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為HPV16/18 DNA陽(yáng)性標(biāo)志，無(wú)著色為陰性。IHC染色Rb評(píng)分參照Karim等[6]提出的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒樣為陽(yáng)性標(biāo)志，高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù) ≥500個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度、所占百分比進(jìn)行判讀，采用7分評(píng)分制。其中，①著色強(qiáng)度：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色染色為1分，無(wú)著色為0分。②陽(yáng)性細(xì)胞百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞1%～5%為1分，>5%～10%為2分， >10%～30%為3分，>30%為4分。兩種判讀方法分?jǐn)?shù)相加，結(jié)果：0分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分中度陽(yáng)性（++），>6分強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。以切片內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞核做內(nèi)對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn);相關(guān)性分析用Spearman檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組HPV16/18 DNA和Rb蛋白表達(dá)比較

IDC組中HPV16/18 DNA陽(yáng)性率高于正常乳腺組和ADH組，Rb蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于正常乳腺組和ADH組（均P < 0.01）。正常乳腺組和ADH組HPV16/18 DNA陽(yáng)性率、Rb蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1～2（封三），表1。

2.2 三組HPV16/18 DNA感染與Rb蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.3 IDC患者HPV16/18 DNA感染、Rb蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

3 討論

研究證實(shí)高危組HPV16、18或33型等可經(jīng)肛門生殖器、血液和淋巴、乳頭甚至通過(guò)性活動(dòng)、母乳喂養(yǎng)等途徑感染人乳腺組織[7]。目前尚不清楚是否HPV感染乳腺組織后作為主要的致病因子或協(xié)同因子促進(jìn)了癌的進(jìn)展還是HPV序列的存在僅是癌中一種一過(guò)性、孤立性的寄生感染[8]。已報(bào)道的研究證實(shí)HPV陽(yáng)性的感染率為1.2%～86.0%[9]。但一些研究未能證實(shí)HPV感染與人乳腺癌之間的關(guān)系[10-11]，該病毒與乳腺癌病因?qū)W之間的關(guān)系仍在探討中[12-14]。

高危型HPV E6及E7是主要病毒癌蛋白，作為病毒整合的結(jié)果，E6及E7蛋白的高水平表達(dá)以及他們與細(xì)胞因子的相互作用可導(dǎo)致乳腺腫瘤的發(fā)展，有研究證明乳腺癌組織中E7的表達(dá)水平高于健康對(duì)照和早期癌癥患者[15-16]。HPV E6作用于p53并通過(guò)泛肽途徑增強(qiáng)其降解，而HPV E7靶向結(jié)合Rb蛋白。在正常的細(xì)胞周期中，非磷酸化的Rb蛋白與E2F特異性結(jié)合，形成Rb-E2F復(fù)合物并抑制E2F對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖。而HPV16/18的E7蛋白通過(guò)自身結(jié)構(gòu)LXCXE氨基酸序列基團(tuán)優(yōu)先與非磷酸化的Rb蛋白結(jié)合致其磷酸化，Rb-E2F復(fù)合物解離，釋放的E2F可與DPI蛋白形成二聚體，由此活化G1期進(jìn)入S期的靶基因并導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄增加，細(xì)胞增殖。此外，在E7缺失的狀態(tài)下，E6也具備以不同于E7的方式滅活Rb的功能。Malanchi等[17]證實(shí)HPV16E6蛋白在培養(yǎng)的人原代成纖維細(xì)胞中具有調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的能力，在E6表達(dá)的細(xì)胞中，高水平p16INK4a基因水平下仍出現(xiàn)Rb蛋白過(guò)度磷酸化，E6蛋白通過(guò)增強(qiáng)CyclinA/CDK2復(fù)合物的活性而涉及了Rb蛋白的磷酸化。此外，在表達(dá)E6蛋白的細(xì)胞中CDK2的抑制劑p21WAF1/CIP1的mRNA和蛋白水平的明顯下調(diào)，認(rèn)為E6具有超磷酸化Rb蛋白的能力，從而涉及了非p53依賴途徑的癌變過(guò)程[18]。因而，當(dāng)宿主細(xì)胞感染HPV16/18型后通過(guò)E6和E7蛋白不同的機(jī)制相互協(xié)同靶向作用于Rb蛋白致其磷酸化，從而在感染的細(xì)胞中涉及抑制凋亡和惡性轉(zhuǎn)化[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IDC組中HPV16/18 DNA陽(yáng)性率高于正常乳腺組和ADH組，Rb蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于正常乳腺組和ADH組（均P < 0.01）。三組HPV16/18 DNA感染與Rb蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)性（均P < 0.05）。HPV16/18 DNA的感染、Rb蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期密切相關(guān)（P < 0.01）。提示HPV16/18 DNA感染后通過(guò)滅活Rb蛋白的功能可能在女性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中起到關(guān)鍵的作用。ADH組和IDC組HPV16/18陰性患者中Rb蛋白高表達(dá)可能反映了機(jī)體對(duì)細(xì)胞增殖異常的一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在不同病變?nèi)橄俳M織中觀察HPV16/18 DNA和Rb蛋白之間的表達(dá)狀態(tài)可了解細(xì)胞癌變發(fā)生期間或之前乳腺組織HPV感染的頻率和Rb蛋白存在的狀態(tài)及其與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。同時(shí)結(jié)合導(dǎo)管上皮增生的形態(tài)學(xué)改變可為臨床客觀評(píng)價(jià)HPV16/18感染后乳腺導(dǎo)管上皮的增生-惡性轉(zhuǎn)化的漸進(jìn)過(guò)程以及對(duì)臨床病理特征的影響，為腫瘤的早期診斷、臨床預(yù)后評(píng)估和指導(dǎo)臨床治療提供新的思路。

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（收稿日期：2020-01-03）