馮月男 孫思邈 張玉昆

[摘要] 目的 運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探尋補陽還五湯防治血栓形成的活性成分、靶點及信號通路。 方法 運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）檢索藥物，結(jié)合生物利用度和類藥性兩個藥動學(xué)參數(shù)篩選補陽還五湯的活性成分及對應(yīng)作用靶點;運用Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫以血栓形成（thrombosis）為關(guān)鍵詞找尋疾病相關(guān)靶基因，將藥物與疾病靶基因取交集，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點名稱校正，利用Cytoscape軟件構(gòu)建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。將所得藥物-疾病靶基因輸入STRING在線數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，得出核心基因，進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析。 結(jié)果 補陽還五湯有61個有效活性成分，藥物-疾病交集基因63個，參與作用的生物過程69個，作用通路有115個，主要參與調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF）、PI3K-AKt、白細(xì)胞介素（IL）-17、NF-κB信號通路。 結(jié)論 補陽還五湯可通過調(diào)節(jié)多個基因調(diào)控多個信號通路治療血栓性疾病，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點、多通路的特點。

[關(guān)鍵詞] 補陽還五湯;血栓形成;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點;信號通路

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（b）-0017-05

[Abstract] Objective To explore the active components， targets and signal pathways of Buyang Huanwu Decoction in preventing thrombosis by using network pharmacology method. Methods The traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform （TCMSP） were used to retrieve drugs， and the active ingredients and corresponding targets of Buyang Huanwu Decoction were selected by combining the two pharmacokinetic parameters of bioavailability and drug-like properties. Genecard and OMIM database were used to find disease-related target genes with the keywords of thrombosis. Drug and disease target genes were intersected， target names were corrected using Uniprot database， and compound-target-disease network was constructed by Cytoscape software. The obtained drug-disease target genes were input into STRING online database to draw PPI network diagram， and the core genes were obtained， and GO and KEGG pathway enrichment analysis were performed. Results Buyang Huanwu Decoction had 61 effective active components， 63 drug-disease intersection genes， 69 biological processes involved and 115 signaling pathways， which were mainly involved in the regulation of tumor necrosis factor （TNF）， PI3K-Akt， interleukin （IL）-17 and NF-κB signaling pathways. Conclusion Buyang Huanwu Decoction can regulate multiple genes to regulate multiple signaling pathways to treat thrombotic diseases， reflecting the characteristics of multiple ingredients， multiple targets and multiple pathways of traditional Chinese medicine compound.

[Key words] Buyang Huanwu Decoction; Thrombosis; Network pharmacology; Target; Signaling pathways

根據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)（the global burden of disease， GBD）研究結(jié)果顯示，腦卒中是全球第二大致死原因[1]，其中缺血性卒中占全部腦卒中的比例為50%～70%。血栓形成是引起缺血性疾病的主要原因，因此血栓的防治在這些疾病的治療過程中顯得尤為重要。中藥方劑對于血栓疾病的預(yù)防及治療有著重要的作用，中藥方劑由多味藥組成，其療效是配伍后的有效成分共同發(fā)揮的作用。方劑的多個有效成分決定了其作用靶點的多樣性，使得每個復(fù)方對應(yīng)病癥都有著一個復(fù)雜但卻獨特的網(wǎng)絡(luò)，運用這個網(wǎng)絡(luò)來分析復(fù)方的作用機制或者配伍規(guī)律使藥物和疾病之間的復(fù)雜關(guān)系更加明了化的方法稱為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[3-5]。

補陽還五湯是治療氣虛血瘀證的經(jīng)典名方，具有補氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)之功效[6]?，F(xiàn)代國內(nèi)外學(xué)者對于補陽還五湯對血栓形成的研究已經(jīng)從宏觀到達(dá)了分子生物學(xué)層次，但對于補陽還五湯具體的作用靶點，參與的生物過程，調(diào)控多少條通路的系統(tǒng)研究還不太多。本文以補陽還五湯為探針，以其對血栓形成的有效成分-靶點-通路為研究對象深入探討補陽還五湯干預(yù)血栓形成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 補陽還五湯化學(xué)成分的收集與靶標(biāo)基因預(yù)測

以補陽還五湯中黃芪、歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花作為關(guān)鍵詞檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）得出本方所含化合物及靶基因，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-like，DL）≥0.18為篩選條件，通過Uniprot將中藥對應(yīng)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配。

1.2 血栓形成疾病相關(guān)基因收集

將關(guān)鍵詞thrombosis錄入Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫收集合并疾病相關(guān)基因。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件中的Merge插件將藥物作用靶點與血栓形成相關(guān)基因取交集，構(gòu)建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將“1.3”取得的交集基因錄入在線STRING平臺，構(gòu)建靶點之間的PPI，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用插件CentiScape得出核心基因，并以PPI中出現(xiàn)次數(shù)最多的前30個基因為縱坐標(biāo)，以在網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的次數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制柱形圖。

1.5 GO生物功能富集分析與KEGG信號通路富集分析

利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫將補陽還五湯作用血栓形成的靶基因進(jìn)行GO分析與KEGG通路富集分析，利用Omicshare平臺轉(zhuǎn)換成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

補陽還五湯775個化合物中符合篩選條件的化學(xué)成分共131個，合并藥味間共有成分，藥物有效活性成分共61個。七味藥物共5320個對應(yīng)靶點，疾病相關(guān)基因共2423種，共得到63個疾病與藥物的交集基因。見圖1。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因篩選

PPI網(wǎng)絡(luò)包含63個節(jié)點，544條相互作用關(guān)系（連線）。見圖2。將PPI結(jié)果以TSV形式導(dǎo)出，再導(dǎo)入Cytoscape軟件，根據(jù)“度”“度介中心度”和“接近中心度”分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，篩選出核心靶點網(wǎng)絡(luò)。其中排在前30位的核心基因結(jié)果見圖3。

2.3 GO生物功能分析和KEGG通路富集分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)共參與生物學(xué)過程69個，其中類固醇結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、核受體活性等生物過程與血栓形成有直接關(guān)系，圖4（封三）為評分最高的前20個。共獲得了115條信號通路，其中腫瘤壞死因子（TNF）、PI3K-AKt、白細(xì)胞介素（IL）-17、核因子（NF）-κB信號通路與血栓形成聯(lián)系緊密。見圖5（封三）。選取與本研究相關(guān)且評分最高的TNF信號通路為例，展示以補陽還五湯為探針對血栓形成影響的TNF信號通路作用圖。見圖6。

3 討論

血栓形成是引起心血管疾病的主要原因之一，而多數(shù)的炎癥信號通路均通過組織因子（TF）的表達(dá)、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化以及聚集加劇血栓形成和發(fā)展[7]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出的通路中TNF、PI3K-Akt、IL-17、NF-κB信號通路均屬于炎癥信號通路，且與血栓形成有著密切關(guān)系。

TNF信號通路：TNF-α是由血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的炎癥因子。TNF-α通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激使其分泌IL-1，同時誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中血小板活化因子（PAF）的生成，增強血小板的促凝功能，與血栓形成呈正相關(guān)[8-9]。TNF-α還可促進(jìn)TF的產(chǎn)生與表達(dá)，抑制血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）的表達(dá)，激活凝血途徑，下調(diào)機體抗凝功能[10]。TNF家族可使NF-κB通路活化，NF-κB的高度活化能紊亂微血管的纖溶系統(tǒng)，從而導(dǎo)致血栓形成[11-12]。同時，NF-κB參與重要免疫受體的調(diào)節(jié)，NF-κB的過度活化又可引起TNF-α、IL-1等致炎癥因子的大量合成和釋放[13-14]，有利于血栓的形成。

PI3K-AKt信號通路：是誘導(dǎo)血小板內(nèi)顆粒物釋放、激活及黏附的重要信號通路[15]，PI3K激酶可使血小板顆粒分泌及活化[16]，而血小板活化是引起血栓形成的主要原因之一。PI3K家族中的PI3Kγ和PI3Kβ的雙重激活使TPO通過TXA2途徑增強血小板功能，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血;PI3KC2α能保持血栓在血流中形態(tài);PI3K vps34可通過影響氮氧化物的組裝調(diào)節(jié)血小板活性[17-18]。PI3K-AKt的激活還可以使下游的IκBKA上調(diào)，從而激活NF-κB通路誘導(dǎo)多種靶基因參與調(diào)控血栓形成。因此研究PI3K-AKt通路對于研究心血管疾病與血栓生成的關(guān)系具有重要意義。

IL-17信號通路：IL-17家族是一類炎癥因子，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)。IL-17A作用于血管和心臟細(xì)胞，可導(dǎo)致炎癥、凝血和血栓形成[22]。IL-17能激活NF-κB通路，調(diào)節(jié)基因黏附分子和炎癥相關(guān)因子VCAM-1、ICAM-1、IL-6等，其中VCAM-1黏附在受損的內(nèi)皮細(xì)胞上可以誘導(dǎo)血小板活化和黏附[23]，IL-6可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的PAF，PAF在許多心血管疾病發(fā)病過程中扮演重要角色[24-26]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，補陽還五湯可能以NF-κB通路為核心，通過TNF、PI3K-AKt、IL-17信號通路對抗血栓形成，下一步我們將圍繞著分析結(jié)果進(jìn)行具體的實驗驗證。

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（收稿日期：2020-05-08）