孫卓然，田金鳳，尚遠(yuǎn)宏

（1.呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；2.攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

水產(chǎn)品是人類食用蛋白質(zhì)的重要來源之一，而水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的藥物殘留將會(huì)對(duì)行業(yè)發(fā)展和人體健康產(chǎn)生不利的作用?？ò脱酰╟arbadox）和喹乙醇（olaquindox）屬于喹啉類藥物，由于其具有明顯的抗菌和促生長作用，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用，但后期證明有較強(qiáng)的毒副作用，已被不同程度地限制或禁止使用[1-2]。3-甲基-喹惡啉-2-羧酸（3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid，MQCA）和喹惡啉-2-羧酸（quinoxaline-carboxylic acid，QCA）分別是喹乙醇和卡巴氧在靶動(dòng)物體內(nèi)的代謝物，被定為殘留檢測(cè)的標(biāo)示物[3]?？ò脱鹾袜掖急旧砭哂袧撛诘闹掳?、致畸作用，二者的代謝物也可能帶來健康風(fēng)險(xiǎn)，因此多個(gè)國家對(duì)二者及其代謝產(chǎn)物QCA和MQCA制定了殘留監(jiān)控的限量標(biāo)準(zhǔn)[4-6]。同時(shí)，我國現(xiàn)執(zhí)行的水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3019—2004《水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定液相色譜法》和農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008有水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅糠治龅母咝б合嗌V方法，但處理方法的靈敏度低，殘留分析的可靠性低；且尚未見直接控制水產(chǎn)品自身組織中卡巴氧的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而只是有對(duì)其飼料中的卡巴氧殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，探討并建立檢測(cè)水產(chǎn)品中喹乙醇和卡巴氧殘留方法，對(duì)于完善和改進(jìn)水產(chǎn)品中2種喹啉類藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)和方法具有實(shí)際意義。

目前，檢測(cè)在動(dòng)物源食品中QCA和MQCA的方法文獻(xiàn)報(bào)道較多，最常用的有液相色譜法[7-8]、免疫法[9-10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-14]，但對(duì)魚類檢測(cè)的應(yīng)用較少。本研究在前人研究工作的基礎(chǔ)上，明確了區(qū)域定位和增加且細(xì)化了檢測(cè)品種，極大提高了方法的靈敏度。實(shí)驗(yàn)以金沙江攀枝花江段6種常見商品魚為研究為對(duì)象，適當(dāng)改進(jìn)了樣品前處理方法，建立了魚組織中QCA和MQCA殘留的超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromategr-aphy-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法，為魚組織中QCA和MQCA殘留的評(píng)估檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品來源于金沙江攀枝花江段6種常見魚（羅非魚、草魚、鯉魚、鰱魚、鯽魚、鯰魚），且以羅非魚作為方法驗(yàn)證樣品，本地市場(chǎng)或養(yǎng)魚場(chǎng)隨機(jī)購得，鮮活的羅非魚、鯉魚等水產(chǎn)品去鱗、去皮、沿背脊取肌肉，充分絞碎，均質(zhì)，-20 ℃以下避光保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白酶（5 U/mg）、Tris堿（HOCH2）3CNH2（純度98.5%）：美國Sigma公司；喹惡啉-2-羧酸（純度98.9%）、3-甲基喹惡啉-2-羧酸（純度98.1%）、喹惡啉-2-羧酸-d4（純度99.5%，QCA-d4）標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲酸、甲醇、乙酸乙酯、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher公司；鹽酸、乙酸、氯化鈣等其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Bond Elut Plexa PAX 固相萃取柱（200 mg/6 mL，使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化，保持柱體濕潤）：美國Agilent 公司；Vortex 4渦旋混合器：比利時(shí)LMS公司；Milli-Q IQ7000超純水器：美國Millipore公司；Nevap-45氮吹儀：美國Organomation公司；FA2014B電子天平：上海越平公司；1-14k離心機(jī)：美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取0.0050 g喹惡啉-2-羧酸、喹惡啉-2-羧酸-d4（同位素內(nèi)標(biāo)，QCA-d4）、3-甲基喹惡啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，-20 ℃避光保存。其他濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇定量混合或逐級(jí)稀釋即得。

1.3.2 樣品前處理

樣品提?。悍謩e稱取6種魚的均質(zhì)樣品5.0 g于50 mL離心管中，加入100 μL 100 μg/mL QCA-d4溶液、8 mL 0.2 mol/L（pH=9.6）Tris緩沖溶液和300 μL 10 mg/mL蛋白酶水溶液，渦旋混勻，置于空氣浴恒溫?fù)u床中47 ℃酶解18 h，取出樣品放置至室溫，再加1 mL濃鹽酸，振搖混勻，4 ℃、9 000 r/min離心5 min。取上層清液加入6 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，4 ℃、9 000 r/min離心5 min，再重復(fù)乙酸乙酯步驟1次，合并兩次上清液。上清液于35 ℃下氮吹濃縮至近干，殘?jiān)?0 mL 20%甲醇水溶解，待凈化。

樣品凈化：將樣品提取液轉(zhuǎn)移至經(jīng)活化的PAX柱。依次用6 mL水、6 mL 2%氨水、6 mL甲醇和6 mL 0.5%乙酸-甲醇淋洗PAX固相萃取柱。然后將PAX柱抽干，用6 mL 2%甲酸-甲醇溶液洗脫目標(biāo)化合物，收集洗脫液，35 ℃下氮吹濃縮至干，用1.0 mL 20%甲醇-水溶液溶解殘?jiān)^0.22 μm濾膜后，備用。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：流動(dòng)相：0.1%的甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；洗脫程序：0～6 min，乙腈由5%線性升至25%；6～7 min，25%乙腈；7.0～7.1 min，乙腈由25%線性降至5%。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；掃描方式為QCA、MQCA、QCA-d4為正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple-reaction monitoring，MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；輔助氣（auxiliary gas flow，AUX）流速：11 L/min；輔助氣溫度：350 ℃。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限的測(cè)定

配制好的QCA和MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成400 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白羅非魚基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成2.0 μg/L、4.0 μg/L、10.0 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L和100 μg/L系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行測(cè)定。以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)和其峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。以3倍信噪比（S/N＞3）和10倍信噪比（S/N＞10）分別確定檢出限（detection limit，LOD）與定量限（limit of quantitation，LOQ）[15-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取與凈化

魚肉樣品含有15%～20%的蛋白質(zhì)和5%左右的脂肪[18]，而喹噁啉類藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留具有基質(zhì)復(fù)雜且固體基質(zhì)內(nèi)源性干擾較大、含量低（痕量）的特點(diǎn)[19]，對(duì)藥物分析的干擾很大，因而必須進(jìn)行樣品前處理。QCA和MQCA與原藥的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差別較大，為有機(jī)強(qiáng)酸，極性較強(qiáng)，在動(dòng)物體內(nèi)通過共價(jià)鍵與一些氨基酸（或蛋白質(zhì)）結(jié)合，需要利用酶水解為游離態(tài)，再進(jìn)行提取，且減少了雜質(zhì)干擾。酶解液經(jīng)鹽酸酸化，乙酸乙酯提取，可有效沉淀蛋白質(zhì)，消除代謝活性物質(zhì)及終產(chǎn)物對(duì)提取的影響，乙酸乙酯洗脫液的雜質(zhì)較少，提高了絕對(duì)回收率。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)比較了不同規(guī)格（60 mg/3mL、200mg/6mL、500mg/6mL）的PAX小柱，直管型柱中填料量和體積過?。?0 mg/3 mL）存在回收率低和柱飽和現(xiàn)象，過大又存在浪費(fèi)特異性固相萃取材料不經(jīng)濟(jì)現(xiàn)象，最后選擇PAX（200 mg/6 mL）柱回收率較高，可有效除去干擾物質(zhì)，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

在MQCA和QCA 殘留分析中使用的流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈體系，因甲酸可以為化合物提供必需的質(zhì)子來源，提高其離子化效率。在ESI+模式下，優(yōu)化碰撞能量，MQCA和QCA經(jīng)過兩級(jí)碰撞掃描后，產(chǎn)生不同強(qiáng)度的離子碎片，以豐度最大的m/z 145、m/z133和m/z 129作為3種化合物的定量離子，MQCA 和QCA的MRM色譜圖見圖1，定量離子色譜圖見圖2，3種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPLC-MS/MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of mixed standard solution analysis by UPLC-MS/MS

圖2 3種化合物的定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatogram of 3 compounds

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下3種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 3 veterinary drugs under MRM mode

由圖1和圖2可知，MQCA和QCA經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進(jìn)入質(zhì)譜，質(zhì)譜連續(xù)掃描進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，每一次掃描得到一張質(zhì)譜圖，將每一張質(zhì)譜圖中所有離子強(qiáng)度相加，得到一個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總的離子流強(qiáng)度。同時(shí)，定量離子色譜圖反映了色譜峰的定性（目標(biāo)化合物的特征離子），峰的一致性測(cè)定。

2.3 方法的線性關(guān)系及檢出限

向空白羅非魚基質(zhì)溶液中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，以峰面積對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。由表2可知，其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）＞0.999。定量限（LOQ）為0.2 μg/kg，檢出限（LOD）為0.05 μg/kg。結(jié)果表明，方法的靈敏度能滿足檢測(cè)要求，并優(yōu)于已有標(biāo)準(zhǔn)[6]和文獻(xiàn)[3，14]。

表2 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits of method

2.4 方法的回收率與精密度

空白的羅非魚樣品分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各6份，搖勻、靜置后按1.3.2方法處理并進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。由表3可知，各添加水平的回收率為91.4%～100.4%，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為6.3%～11.5%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足藥物殘留分析的要求[20]。

表3 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate and precision tests

2.5 實(shí)際樣品分析

目前，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物MQCA的最大殘留限量為4 μg/kg[6]，還沒有對(duì)卡巴氧代謝物QCA制定最大殘留限量。按試驗(yàn)方法對(duì)金沙江攀枝花江段的30份6種常見商品魚（羅非魚、草魚、鯉魚、鰱魚、鯽魚、鯰魚）進(jìn)行分析，其QCA和MQCA的殘留量均低于方法的檢出限，均未檢出。

3 結(jié)論

羅非魚、草魚、鯉魚、鰱魚、鯽魚、鯰魚作為市場(chǎng)流通的常見水產(chǎn)品，其QCA和MQCA殘留也引起越來越多的關(guān)注。雖然我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物MQCA殘留量有限定[6]，但由于魚體中QCA和MQCA殘留對(duì)人類存在健康風(fēng)險(xiǎn)，非常有必要對(duì)魚體中的卡巴氧及喹乙醇代謝物殘留進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控。本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，UPLC-MS/MS法分別測(cè)定金沙江攀枝花江段6種常見商品魚中QCA和MQCA的殘留量均未檢出，本方法靈敏度較好，回收率和重現(xiàn)性符合檢測(cè)要求，達(dá)到了QCA和MQCA殘留分析的要求，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)魚類等水產(chǎn)品中藥物殘留的檢測(cè)方法和限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定的參考依據(jù)。