張瀟分，王燕敏，田國力(上海市兒童醫(yī)院&上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院篩查中心，上海 200040)

遺傳代謝病又稱先天性代謝異常(inborn errors of metabolism，IEM或inherited metabolic diseases，IMD)，是一大類有代謝功能缺陷的復(fù)雜遺傳病，涉及氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、尿素循環(huán)、碳水化合物、類固醇、金屬、溶酶體等多種物質(zhì)代謝障礙的疾病，主要由于基因突變導(dǎo)致機(jī)體生化代謝紊亂或酶活性改變，代謝產(chǎn)物蓄積，具有高度的遺傳異質(zhì)性[1]。研究表明，大多數(shù)IEM屬于單基因遺傳病，以常染色體隱性遺傳或X-連鎖隱性遺傳為主[2]。IEM臨床表型廣泛且通常是非特異性的，并且癥狀的出現(xiàn)可發(fā)生于從胎兒到成年的任何年齡，盡管單一病種發(fā)病率較低但總體發(fā)病率較高，因此，IEM嚴(yán)重影響著人口的素質(zhì)和生存質(zhì)量。目前許多IEM可防、可治，飲食治療、藥物治療、手術(shù)治療及基因治療等可不斷改善部分患者的預(yù)后。對(duì)高?；純哼M(jìn)行IEM篩查，能夠及時(shí)對(duì)疾病做出早期診斷，為患兒的治療、遺傳咨詢等方面提供個(gè)體化方案。

目前IEM實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)包括酶聯(lián)免疫法、熒光法、氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)、串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(tandem mass spectrometry，MS/MS)及下一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)等[3]。隨著分子診斷學(xué)、分子遺傳學(xué)及基因測(cè)序、數(shù)字微流體等技術(shù)的快速發(fā)展，IEM的篩查與檢測(cè)取得了巨大成效。本文主要綜述了實(shí)驗(yàn)室篩查與診斷技術(shù)在遺傳代謝病中的應(yīng)用。

1 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)主要是物質(zhì)被電離成具有不同質(zhì)荷比(m/z)的帶電粒子，這些帶電粒子根據(jù)m/z的大小在空間或時(shí)間上分離，形成圖譜，通過測(cè)定離子峰的強(qiáng)度來確定化合物的分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)和樣品濃度。目前，IEM的篩查與診斷中常用的質(zhì)譜技術(shù)有GC/MS、MS/MS及其他質(zhì)譜技術(shù)等。

1.1GC/MS GC/MS是由色譜分析儀和質(zhì)譜分析儀兩部分組成，它通過氣相色譜儀將混合物中的組分分離后再通過質(zhì)譜儀對(duì)分離的組分進(jìn)行鑒定(定性分析)以及計(jì)算出精確的量(定量分析)。由于IEM中異常的代謝物質(zhì)主要通過尿液排泄，因此，檢測(cè)尿中特征性代謝產(chǎn)物的種類和含量的變化，能夠?yàn)镮EM的診斷提供可靠的依據(jù)。GC-MS技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、高分離度、數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化、一次可檢測(cè)多種異常代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，可以從尿液中檢測(cè)出132種有機(jī)酸，用于40多種代謝病的診斷，是目前常用的遺傳代謝病檢測(cè)方法之一。

自1966年Tanaka報(bào)道通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀發(fā)現(xiàn)首例異戊酸血癥以來，GC-MS在遺傳代謝病的篩查與診斷中廣泛應(yīng)用，并成為有機(jī)酸尿癥的主要診斷方法[4]。羅小平等[5]在2003年時(shí)將GC/MS技術(shù)引入國內(nèi)。田國力等[6]采用GC-MS技術(shù)對(duì)5 778例遺傳代謝病高危兒尿液中132種代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，共有106例患兒被明確診斷出17種疾病，證實(shí)了GC-MS技術(shù)對(duì)有機(jī)酸代謝異常和部分氨基酸代謝異常診斷具有特異性。

尿液作為最常用的生物基質(zhì)之一，具有無創(chuàng)性、背景物質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，由于尿代謝產(chǎn)物受多種因素如飲食、飲水量或疾病狀態(tài)等影響，故而GC/MS檢測(cè)尿有機(jī)酸存在一定的假陰性。另外，采用GC-MS技術(shù)對(duì)尿有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)需對(duì)樣本進(jìn)行前處理，且樣本前處理步驟多，一份樣本檢測(cè)需要1 h，因此不適合使用GC-MS對(duì)大規(guī)?；颊呷巳哼M(jìn)行篩查，但該技術(shù)仍然是目前最常用的遺傳代謝病檢測(cè)方法之一。

1.2MS/MS MS/MS由2個(gè)質(zhì)譜儀經(jīng)1個(gè)碰撞室串聯(lián)而成，理論上2～3 min內(nèi)可對(duì)1個(gè)3 mm濾紙干血片上幾十種代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，判斷數(shù)十種氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸氧化代謝紊亂的疾病，實(shí)現(xiàn)了“1次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種疾病”[7]。樣本采用濾紙干血片，通過鹽酸正丁醇衍生法及非衍生法2種樣本處理方法，對(duì)血中氨基酸及酰基肉堿水平進(jìn)行檢測(cè)，具有高靈敏性、高特異性、快速、高通量的特點(diǎn)。顧學(xué)范等[8]于2002年通過MS/MS對(duì)遺傳代謝病進(jìn)行篩查及檢測(cè)。Céspedes等[9]采用串聯(lián)質(zhì)譜法確定哥倫比亞新生兒血液中氨基酸和?；鈮A的濃度水平，并建立參考區(qū)間以進(jìn)一步用于IEM診斷，表明該技術(shù)在IEM篩查方面具有較高的精確性、準(zhǔn)確性。除小分子物質(zhì)外，目前MS/MS還可對(duì)一些大分子物質(zhì)如溶酶體貯積癥(lysosomal storage disease，LSDs)、線粒體疾病等進(jìn)行檢測(cè)[10]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為遺傳代謝病篩查中應(yīng)用廣泛的分析技術(shù)。在我國，MS/MS已用于新生兒氨基酸代謝障礙、有機(jī)酸血癥及脂肪酸氧化代謝障礙等遺傳代謝病篩查[11]，并形成了新生兒疾病串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)專家共識(shí)[12]。在IEM的診斷方面，通過MS/MS分析高?；純貉褐械陌被岷王；鈮A分布也得到了廣泛應(yīng)用[13]。

MS/MS也具有一定的局限性，一方面質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，另一方面MS/MS是一項(xiàng)非常復(fù)雜的系統(tǒng)，需要專業(yè)的技術(shù)人員來操作，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求高，同時(shí)也需要經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師結(jié)合臨床或其他輔助診斷對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確判讀,將MS/MS與其他生化指標(biāo)如酶學(xué)測(cè)定和分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用也可幫助臨床醫(yī)生準(zhǔn)確診斷患有可疑IEM的患兒。

1.3其他質(zhì)譜技術(shù) 近年來，已經(jīng)開發(fā)出商業(yè)化的超高性能超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPSFC-MS/MS)系統(tǒng)[14]。該系統(tǒng)能將氣相色譜(gas chromatography，GC)的分辨率與超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC)的高通量功能結(jié)合在一起，已用于臨床上類固醇激素的檢測(cè)，這項(xiàng)新技術(shù)由于其復(fù)雜性，尚未完全應(yīng)用于IEM的實(shí)驗(yàn)室篩查及診斷。

2 分子診斷技術(shù)

體內(nèi)的生化代謝物在疾病狀態(tài)和環(huán)境等因素的作用下，濃度水平會(huì)有所波動(dòng)，在檢測(cè)過程中會(huì)有一些假陽性率和假陰性率的存在。基因突變檢測(cè)相對(duì)于代謝物檢測(cè)，結(jié)果更為可靠，診斷價(jià)值更高。分子診斷技術(shù)對(duì)DNA序列或?qū)截悢?shù)變異進(jìn)行分析，找出基因病變的部位，不受生理狀態(tài)和環(huán)境的影響，還能夠進(jìn)一步檢測(cè)出家族中雜合子的攜帶者。因此，分子診斷在IEM的病因?qū)W診斷中占據(jù)重要地位[15]。目前IEM篩查的分子診斷技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序等。

2.1PCR技術(shù) PCR技術(shù)包括高分辨率熔解曲線分析(high resolution melting analysis，HRM)、多重連接依賴式探針擴(kuò)增分析(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)等。HRM可以對(duì)超長脂酰輔酶A脫氫酶缺乏等已知突變或熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，是一種敏感性強(qiáng)、特異性高的檢測(cè)技術(shù)，目前已用于多種IEM基因突變的檢測(cè)[16]。孫婧婧等[17]采用HRM技術(shù)快速診斷1例瓜氨酸血癥Ⅰ型患兒的ASS1基因純合突變。Islam等[16]使用酶法和HRM分析法對(duì)63例臨床可疑女性進(jìn)行了G6PD狀態(tài)評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了G6PD酶測(cè)定，HRM曲線分析可作為對(duì)G6PD雜合子有效補(bǔ)充分析方式。

此外，MLPA可以對(duì)染色體異?；蚧虻目截悢?shù)變異進(jìn)行分析(如復(fù)制或缺失)，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)和點(diǎn)突變，對(duì)mRNA進(jìn)行量化。目前可應(yīng)用于眾多研究領(lǐng)域，如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、苯丙酮尿癥、假性甲狀旁腺機(jī)能減退、丙酸血癥等[18-19]。MLPA是一種具有高靈敏度、高特異性、高通量的檢測(cè)技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。Nagasaki等[20]通過MLPA技術(shù)對(duì)1例有神經(jīng)肌肉癥狀的假性甲狀旁腺功能減退癥Ib型(PHP-Ib)患者GNAS基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其GNAS基因外顯子A/B的甲基化缺陷并涉及GNAS鄰近基因STX16外顯子4～6的微缺失，表明MLPA是篩查臨床非典型癥狀患者GNAS突變的有效工具。

2.2基因芯片技術(shù) 染色體微陣列芯片分析(chromosome microarray analysis，CMA)即染色體基因組芯片，也稱基因芯片技術(shù)。與傳統(tǒng)遺傳學(xué)檢測(cè)方法相比，基因芯片技術(shù)具有高通量的特點(diǎn)，它能夠在1張芯片上對(duì)整個(gè)基因組的基因拷貝變異(copy number variations，CNVs)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，基因芯片檢測(cè)效率較高，能夠檢測(cè)小于1×105bp甚至1×103bp的拷貝數(shù)變異。由于IEM種類繁多，50%～70%的IEM發(fā)生在兒童，以智力發(fā)育遲緩合并其他組織器官異常多見，臨床表現(xiàn)復(fù)雜。目前基因芯片技術(shù)在不明原因的兒童發(fā)育遲緩、智力落后、多發(fā)畸形等方面的臨床應(yīng)用已獲得美國FDA批準(zhǔn)，在該方面的應(yīng)用相對(duì)成熟[21]。近幾年，我國CMA的臨床應(yīng)用逐步推廣，為眾多遺傳病患者提供了精確分子診斷，形成了CMA在兒科遺傳病的臨床應(yīng)用專家共識(shí)，共識(shí)中對(duì)具有以下臨床表型的疾病，建議將CMA作為一線檢測(cè)手段，包括：(1)不明原因的智力落后和(或)發(fā)育遲緩；(2)非已知綜合征的多發(fā)畸形；(3)自閉癥譜系障礙。

2.3Sanger測(cè)序 Sanger測(cè)序技術(shù)屬于經(jīng)典的基因診斷技術(shù)，能夠?qū)⒒蛑胁糠中∑蔚牟迦?缺失突變以及大部分的點(diǎn)突變檢測(cè)出來。是目前在IEM實(shí)驗(yàn)室篩查與診斷中應(yīng)用最為廣泛、最成熟的分子診斷技術(shù)。謝波波等[22]采用Sanger測(cè)序?qū)?例瓜氨酸血癥Ⅰ型進(jìn)行家系基因檢測(cè)，并對(duì)ASS1基因14個(gè)外顯子進(jìn)行DNA測(cè)序，檢測(cè)到患兒存在c.951delT(F317LfsX375)和c.1087C >T (R363W)2個(gè)雜合突變，并闡明其病因，為該病的診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。但由于Sanger測(cè)序技術(shù)通量不足，檢測(cè)范圍有限，使其在應(yīng)用上還存在一定的局限性。

2.4NGS NGS能夠在一次實(shí)驗(yàn)中快速完成對(duì)個(gè)體的全基因組測(cè)序，檢測(cè)單個(gè)個(gè)體全部的DNA序列，對(duì)DNA序列的點(diǎn)突變、重復(fù)、缺失及序列多態(tài)性等進(jìn)行揭示，相對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)，具有高靈敏度、高通量，低成本的優(yōu)勢(shì)，在單基因遺傳病的基因篩查和診斷中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。NGS技術(shù)按測(cè)序目標(biāo)序列的大小，可分為全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)和靶向重測(cè)序。靶向重測(cè)序又可分為全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing，WES)、臨床外顯子組測(cè)序(medical exome sequencing，MES)、靶向疾病基因包(Panel)等?；谙乱淮鷾y(cè)序技術(shù)，特別是利用WES和WGS 兩種方法發(fā)現(xiàn)基因變異，被越來越多的應(yīng)用于IEM的篩查與臨床診斷中。近年來，利用NGS技術(shù)進(jìn)行IEM分子診斷的研究獲得越來越多的關(guān)注。目前，已建立了針對(duì)脂質(zhì)沉積性肌病[23]、溶酶體貯積病[24]、嬰兒型線粒體疾病[25]、先天性糖基化缺陷病[26]等疾病的分子診斷方法，取得了良好的效果。

有學(xué)者采用NGS技術(shù)對(duì)72例高?；純哼M(jìn)行WES，共發(fā)現(xiàn)了98個(gè)不同的突變，其中27個(gè)未見報(bào)道，其還發(fā)現(xiàn)43.06%(31/72)的患兒患有11種常見疾病，其中多數(shù)是IEM和神經(jīng)遺傳性疾病[27]。Yang等[28]應(yīng)用WES技術(shù)對(duì)250個(gè)不同表型的遺傳性疾病患者進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)至少有25%的患者得到明確的基因診斷。Lindstrand等[29]對(duì)高危患兒IME的診斷使用短讀WGS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于臨床染色體微陣列分析(CMA)，其總體診斷率提高了27%，使用WGS還可以高精度檢測(cè)到各種結(jié)構(gòu)變異(structural variant，SV)，由于WGS數(shù)據(jù)可以分析單核苷酸變異(single nucleotide variants, SNV)，單親二倍體(uniparentaldisomy，UPD)和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)，故而在臨床診斷實(shí)驗(yàn)室中常用于綜合基因測(cè)試。

NGS技術(shù)已成為目前診斷IEM新致病基因的重要研究工具。但由于NGS技術(shù)還在發(fā)展中，臨床應(yīng)用的時(shí)間也較短，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的DNA突變需進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)于意義不明的新突變亦需進(jìn)一步進(jìn)行功能學(xué)的研究，確定其是否具有臨床意義。對(duì)于某些DNA變異，其致病性不能確定；對(duì)于查出的一些致病基因，患兒會(huì)何時(shí)發(fā)病也不能確定；發(fā)病后何時(shí)干預(yù)以及如何進(jìn)行干預(yù)、如何做好遺傳咨詢；建立實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作；以上都會(huì)給NGS技術(shù)在IEM中的全面應(yīng)用帶來極大的挑戰(zhàn)。

3 數(shù)字微流體技術(shù)

數(shù)字微流控技術(shù)(digital microfluidics，DMF)是一種新興的液體處理技術(shù)，可以在軟件控制下將液體作為離散的微滴進(jìn)行處理。這些皮升至微升大小的液滴，每個(gè)都可以作為化學(xué)反應(yīng)的微容器，使流體在其中分配、運(yùn)輸、混合、孵育和檢測(cè)。

DMF技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)高效的新平臺(tái)，目前用于IEM實(shí)驗(yàn)室篩查的免疫測(cè)定和酶活性測(cè)定方法都可以在一次性微芯片上進(jìn)行。將DMF技術(shù)和納米電噴離子化MS/MS結(jié)合使用,可將樣本提取、衍生化和代謝物分析整個(gè)過程集中在1個(gè)芯片上，整個(gè)過程中消耗的樣品和試劑大約是等效臺(tái)式測(cè)定所需的樣品和試劑的1%，很大程度上增加檢測(cè)通量，減低檢測(cè)成本[30]。高通量DMF平臺(tái)(又稱為SEEKER)最近獲得了美國FDA的授權(quán)，該平臺(tái)可以針對(duì)4種溶酶體酶進(jìn)行多重測(cè)定，可以同時(shí)篩查包括Ⅰ型粘多糖貯積病(mucopolysaccharidosis type I，MPSI)、龐貝氏癥(Pompedisease)、戈謝病(Gaucherdisease)和法布里病(Fabry)在內(nèi)的4種溶酶體貯積病(lysosomal storage disorders，LSD)，并且已經(jīng)加入了美國新生兒篩查計(jì)劃中[31]。除了免疫學(xué)和酶學(xué)檢測(cè)，還可使用基于DMF的微芯片和控制設(shè)備對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。有學(xué)者通過基于DNA方法的DMF技術(shù)對(duì)T細(xì)胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circles，TREC)進(jìn)行檢測(cè)，以篩查新生兒或高?；純褐匕Y聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency，SCID)[32]。以上方法表明，DMF技術(shù)在IEM篩查和檢測(cè)中具有較大的臨床應(yīng)用潛力。

4 結(jié)語

個(gè)體化醫(yī)療與精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展很大程度上依賴于準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)結(jié)果。高新檢測(cè)技術(shù)如質(zhì)譜技術(shù)、分子診斷技術(shù)和微流體技術(shù)有望在IEM實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)領(lǐng)域帶來革命性的變化。隨著IEM各種診斷新技術(shù)的快速發(fā)展，將規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化貫穿于整個(gè)檢測(cè)過程，才能最大程度上使新技術(shù)在IEM檢測(cè)中獲得收益，臨床醫(yī)師也應(yīng)提高對(duì)結(jié)果的正確解讀能力。目前來講，將各種篩查技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可對(duì)IEM進(jìn)行全面檢測(cè)，能顯著提高靈敏度及特異性，避免單一方法的漏診，這也是未來的發(fā)展方向之一。