王澤華，應(yīng)苗法，趙蕊，李明星(.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院藥劑科，杭州 3006; 2.杭州市下沙醫(yī)院藥劑科，杭州 3008)

近年來，Crispr/Cas系統(tǒng)發(fā)展迅速，在研究細(xì)胞功能和臨床治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，其中靶向切割DNA特定位點(diǎn)的Cas9和Crispr效應(yīng)蛋白Cpf1已被應(yīng)用于各種基因組的編輯，但調(diào)控RNA的分子工具非常有限[1-2]。在生物界，RNA幾乎參與了所有的生物活動(dòng)，除了參與蛋白質(zhì)的表達(dá)，還參與了基因表達(dá)[3]。目前，一種新型的RNA靶向的Ⅱ類Ⅵ型Crispr系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas13被開發(fā)出來，其能夠特異性靶向并剪切RNA，隨后對附近的RNA片段進(jìn)行無差別的“附帶剪切”，具有致休眠或程序性的凋亡效應(yīng)。利用該脫靶效應(yīng)，許多學(xué)者開發(fā)了一系列用于疾病診斷的工具，并應(yīng)用于抗病毒及抗腫瘤等疾病治療[4-7]。通過Cas13亞型篩選及功能性蛋白殘基的改造，結(jié)合其他RNA操縱酶，進(jìn)一步提高Cas13酶活性和特異性，改變Cas13酶功能，能夠?qū)崿F(xiàn)RNA敲除、編輯、示蹤等轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控[8]。Cas13具有靶向性、特異性、安全性較高的優(yōu)勢，但是目前Cas13在真核生物上的研究仍不足，深入研究Cas13多功能RNA調(diào)控系統(tǒng)對于揭示疾病的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。本文主要總結(jié)RNA靶向的Crispr/Cas13系統(tǒng)的特點(diǎn)和作用機(jī)制，并對其在分子診斷和疾病治療中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Crispr/Cas13系統(tǒng)的特點(diǎn)及作用機(jī)制

Cas13是一種RNA靶向剪切的新型CRISPR酶，與靶向DNA的核酸酶Cas9不同。Cas13具有加工crRNA和crRNA介導(dǎo)的RNA靶向剪切的雙重核酸酶活性，能夠特異性識(shí)別靶向RNA片段，激活后特異性剪切靶向片段，Cas13還具備非特異性RNA核糖核苷酸酶(RNA ribonuclease, RNase)活性，隨后對附近的RNA片段進(jìn)行無差別的“附帶剪切”，參與調(diào)控基因的表達(dá)及細(xì)胞功能學(xué)的穩(wěn)態(tài)。

1.1Crispr/Cas13系統(tǒng)的特點(diǎn) 古生菌和約50%的細(xì)菌都具備Crispr/Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，它能夠幫助微生物抵抗病毒或外來核酸[9-10]。靶向DNA的Crispr/Cas系統(tǒng)，例如Crispr/Cas9和Crispr/Cas12a是人類操縱和研究DNA、研究基因功能以及揭露生物學(xué)機(jī)制的重要工具，在基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化研究上得到了廣泛應(yīng)用[11-13]。與Cas9類似，Cas13屬于Ⅱ類Ⅵ型Crispr系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，含有2個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)結(jié)合域。Abudayyeh等[14]對Crispr/Cas13系統(tǒng)進(jìn)行深入研究，首次證實(shí)了Cas13是一種RNA靶向剪切的新型Crispr酶。

Cas13家族包含4種亞型，即Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d[15-16]。Cas13a是一種雙組件系統(tǒng)，其結(jié)合域的催化位點(diǎn)在蛋白質(zhì)外表面，只需1條crRNA介導(dǎo)，對RNA進(jìn)行順式或反式切割。Cas13b系統(tǒng)缺少Cas1和Cas2，具有RNase，靶向RNA的二級結(jié)構(gòu)，Crispr/Cas系統(tǒng)中未描述的相關(guān)蛋白Csx28能增強(qiáng)Cas13b介導(dǎo)的RNA干擾，Csx27對其有抑制作用[17]。Cas13d類蛋白平均長度要比Cas13a和Cas13c短190～300個(gè)氨基酸序列，由于其長度短，通過調(diào)控Cas13d效應(yīng)器，可用于RNA的調(diào)控和檢測[18]。對于Cas13c系統(tǒng)，目前缺乏相關(guān)的研究。

1.2Crispr/Cas13系統(tǒng)的作用機(jī)制 Cas13具有雙重酶活性，能夠?qū)⑶绑wcrRNA加工成為成熟的crRNA，并憑借crRNA介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶向RNA剪切[4]。Cas13利用向?qū)NA實(shí)現(xiàn)RNA準(zhǔn)確靶向，向?qū)NA包括短發(fā)卡結(jié)構(gòu)和間隔序列，其中Cas13通過識(shí)別向?qū)NA的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)并與其形成復(fù)合物，并通過間隔序列片段識(shí)別能夠互補(bǔ)的靶向區(qū)域，并進(jìn)行靶向識(shí)別剪切，它的剪切具備前間隔序列側(cè)翼位點(diǎn)(protospacer-flanking site, PFS)結(jié)構(gòu)依賴性，即在原間隔序列前的堿基應(yīng)當(dāng)為A、C或U[14,19]。特殊的是，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在原核細(xì)胞內(nèi)，Cas13識(shí)別RNA并進(jìn)行特異性剪切之后，并未失活，其還具有“附帶剪切”的RNase活性，能夠剪切鄰近的單鏈RNA，引起細(xì)胞休眠或細(xì)胞程序性死亡[4,14](圖1)。但是Cas13這種非特異性RNase活性卻為其在核酸檢測及疾病治療方面的應(yīng)用提供了啟示。

注：Phage RNA,噬菌體RNA；Mature crRNA,成熟的RNA；host mRNA,宿主mRNA；Collateral cleavage,附帶剪切。

圖1 RNA靶向的原核生物免疫系統(tǒng)Crispr/Cas13的靶向機(jī)制

2 Crispr/Cas13系統(tǒng)在分子診斷中的作用

目前，許多基于多聚酶的方法被應(yīng)用于RNA擴(kuò)增和后續(xù)的檢測，但其中的大多數(shù)方法都需要對RNA靶向片段進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，且RNA靶向片段具有嚴(yán)格的設(shè)計(jì)限制[20-21]。Cas13能通過crRNA介導(dǎo)特異性識(shí)別靶向RNA片段，激活后特異性剪切靶向片段，隨后進(jìn)行無差別的“附帶剪切”，雖然該活動(dòng)對細(xì)胞生存不利，但利用RNA引起的爆發(fā)性的底物非特異性剪切應(yīng)用于特定RNA檢測[14]。Crispr/Cas13應(yīng)用于核酸檢測具備特異性高的特點(diǎn)，RNA靶向的Crispr/Cas13系統(tǒng)特異性達(dá)到單堿基錯(cuò)配，并且其剪切具備PFS依賴性；另外，Cas13還具有較高的RNase活性，利用該系統(tǒng)進(jìn)行檢測靈敏度較高。

Cas13具備非特異性剪切的“附帶剪切”活性，利用該系統(tǒng)能特異性識(shí)別剪切靶向RNA片段并引發(fā)后續(xù)的非特異性剪切，通過引入猝滅熒光RNA報(bào)告基因能夠?qū)崿F(xiàn)特定核酸片段的檢測[4]。當(dāng)crRNA介導(dǎo)Cas13特異性識(shí)別靶向RNA片段，RNA報(bào)告基因通過RNA連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，激活Cas13酶活性，除了進(jìn)行目標(biāo)RNA的特異性剪切，還將進(jìn)行無差別的“附帶剪切”，切斷連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的RNA鏈，猝滅效應(yīng)消失，可以通過檢測熒光信號進(jìn)行特定核酸檢測。研究發(fā)現(xiàn)，靶向的RNA濃度在1～10 pmol/L時(shí)，僅0.02%的Cas13a系統(tǒng)被激活，而剪切效率卻達(dá)到25%～50%，每個(gè)靶向剪切將會(huì)導(dǎo)致后續(xù)數(shù)十萬個(gè)非特異性靶向剪切，信號進(jìn)行放大，隨后能在30 min內(nèi)檢測到特異性增強(qiáng)的熒光信號；但是，pmol/L級別的檢測濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到臨床需求，故而更多策略被設(shè)計(jì)用來提高RNA的檢測限[4]。

由于上述檢測方式未達(dá)到臨床檢測靈敏度，一種高靈敏度報(bào)告基因開鎖法(high-sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing, SHERLOCK)在2017年由美國學(xué)者Gootenberg等[22]提出，該技術(shù)是通過重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)，對樣本中DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增，使得檢測閾值達(dá)到單拷貝級別，這種擴(kuò)增是等溫?cái)U(kuò)增，可以在常溫下進(jìn)行，擴(kuò)增后的DNA在進(jìn)行T7核糖核酸聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后，引入Cas13a工具進(jìn)行檢測，一旦含有標(biāo)靶RNA序列，便會(huì)大量剪切REPORT分子，檢測到熒光信號，具有較高的靈敏度。引入了RPA之后，SHELOCK技術(shù)能夠檢測到amol/L級濃度的RNA或DNA，顯著提高了Crispr/Cas13系統(tǒng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。SHERLOCK技術(shù)能夠檢測在血液中或尿液中的寨卡病毒和登革熱病毒，識(shí)別特定的細(xì)菌類型，檢測耐藥基因，識(shí)別游離的DNA中的癌癥突變，快速閱讀人類遺傳信息的改變。

然而，這項(xiàng)技術(shù)也存在短板，如在1個(gè)反應(yīng)中只能檢測1個(gè)靶點(diǎn)，并且對檢測設(shè)備要求較高，對此學(xué)者們又研發(fā)了第二代的SHELOCK技術(shù)。相較于第一代SHERLOCK，第二代SHERLOCK具備成本低，效率高，檢測速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，主要表現(xiàn)在以下4個(gè)方面：(1)在通道檢測上，通過不同Cas亞型對于核苷酸序列的剪切取向，能夠通過使用不同亞型Cas系統(tǒng)，在單反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)4個(gè)通道的檢測；(2)能夠進(jìn)行定量測定，且靈敏度達(dá)到2 amol/L；(3)在靈敏度上，第二代的SHELOCK又進(jìn)行了改進(jìn)，通過結(jié)合Cas13和Crispr 系統(tǒng)內(nèi)切核糖核酸酶6(Crispr system endoribonuclease enzyme 6, Csm6)實(shí)現(xiàn)信號進(jìn)一步放大，靈敏度達(dá)到第一代SHELOCK的3.5倍，Csm6能夠被Cas13附帶剪切后的產(chǎn)物激活，進(jìn)一步剪切富含A-C堿基序列的報(bào)告基因，通過連接不同的熒光分子，可以實(shí)現(xiàn)多通道或單通道信號放大檢測；(4)通過開發(fā)SHELOCK試紙，受試者僅通過試紙上陽性條帶的觀察，便能確定檢測結(jié)果[5]。

3 Crispr/Cas13系統(tǒng)在疾病治療中的應(yīng)用

Cas13具備非特異性剪切的“附帶剪切”活性，主要應(yīng)用于病毒快速檢測、菌型鑒定、耐藥基因和癌癥疾病突變檢測等方面，除此之外，利用該特性在抗病毒和抗腫瘤等疾病治療中的應(yīng)用也得以拓展。Cas13具備的RNA特異性識(shí)別與剪切的特性也使其成為RNA編輯的有效工具，具備特異性高的特點(diǎn)。Crispr/Cas13的核酸編輯功能或許能為許多基因類疾病治療提供另一種途徑，尤其是RNA水平變化導(dǎo)致的疾病。

3.1抗病毒作用 Crispr/Cas13能夠保護(hù)古生細(xì)菌或者原核生物免受RNA噬菌體或外來核苷酸侵襲，它通過特異性剪切和crRNA互補(bǔ)的RNA片段達(dá)到抗單鏈RNA病毒的目的，這種活性被利用來進(jìn)行抗病毒治療。Bawage等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過Crispr/Cas13a系統(tǒng)設(shè)計(jì)和篩選幾種crRNA，并通過靶向類呼吸道合胞體病毒(human respiratory syncytial virus, hRSV)和甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)，從而裂解病毒RNA和核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)，達(dá)到抗病毒的作用；但病毒RNP的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)含量以及RNP基因組的構(gòu)成對crRNA和Cas13a的靶向性具有影響。Freije等[6]研發(fā)了一種名為Cas13輔助限制病毒表達(dá)和讀出(Cas13-assisted restriction of viral expression and readout, CARVER)的工具，結(jié)合Cas13的病毒殺傷和其診斷衍生化工具SHERLOCK，通過計(jì)算機(jī)從數(shù)百個(gè)可能感染人類的病毒中篩選出幾千個(gè)有潛能的Cas13 crRNA 靶向片段，進(jìn)行靶向抗病毒治療，并通過SHERLOCK檢測Cas13抗病毒治療后的病毒RNA水平和crRNA突變情況，提示Cas13在抗病毒方面的療效較好。另有研究發(fā)現(xiàn)，Cas13能有效抵抗淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)、IAV和水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis, VSV)[6]。CARVER平臺(tái)能有效抗病毒治療，并且能夠快速實(shí)時(shí)檢測病毒RNA水平，反饋治療結(jié)果，提示Crispr/Cas13在實(shí)現(xiàn)診療一體化的抗病毒治療中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

3.2抗腫瘤作用 Crispr/Cas13系統(tǒng)在真核細(xì)胞中的應(yīng)用仍然處于探索期。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在表皮生長因子受體變異體Ⅲ (epidermal growth factor receptor variant Ⅲ, EGFRv Ⅲ)過表達(dá)的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(human glioblastoma, GBM)中，Cas13a識(shí)別靶向基因后，觸發(fā)“附帶剪切”，引發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡；其進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Crispr/Cas13a系統(tǒng)能夠有效抑制EGFRv Ⅲ人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞在小鼠顱內(nèi)的原位進(jìn)展，具有強(qiáng)大的腫瘤抑制作用，提示Crispr/Cas13a在治療膠質(zhì)瘤方面展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。

3.3對遺傳性疾病的治療作用 RNA在生命過程中起非常重要的作用，但是能夠進(jìn)行RNA干擾的分子工具非常有限。有研究報(bào)道，直系同源的Cas13系統(tǒng)在原核生物內(nèi)發(fā)生混亂剪切，但在哺乳類細(xì)胞宿主轉(zhuǎn)錄組很少出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，提示Crispr/Cas13系統(tǒng)可能成為調(diào)控真核生物基因轉(zhuǎn)錄后水平的重要手段[8,23-24]。Abudayyeh等[8]提出，通過改造Cas13a，能夠干預(yù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA。另有研究發(fā)現(xiàn)，Cas13a直系同源中Lwa-Cas13a能夠在哺乳細(xì)胞中表達(dá)，并且能有效敲除報(bào)告基因或者內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本，提高了特異性，降低了脫靶性，該研究利用Lwa-Cas13a成功降低了人胚腎細(xì)胞和黑色素細(xì)胞中鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、趨化因子受體4(CXC chemokine receptors 4,CXCR4)和肽基脯氨酰異構(gòu)酶B(peptidylprolyl isomerase B,PPIB)3個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)[25-26]。雙同源框4(double homeobox 4, DUX4)異常表達(dá)導(dǎo)致面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥(facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD)的發(fā)生，常伴有肌肉萎縮和無力癥狀。Rashnonejad等[27]設(shè)計(jì)了靶向DUX4mRNA不同區(qū)域的片段Cas13b-gRNA 片段，成功抑制了DUX4蛋白表達(dá)，并且成功抑制體內(nèi)外細(xì)胞死亡，提示Cas13作為RNA干預(yù)工具的臨床應(yīng)用前景。

RNA編輯作為一種更為安全的編輯技術(shù)，可逆性地逆轉(zhuǎn)RNA信息，避免造成永久性突變，成為研究和臨床疾病治療的重要工具[28]。為了擴(kuò)展Cas13系統(tǒng)在RNA研究上的應(yīng)用，有學(xué)者通過改變Cas13酶HEPN區(qū)域的功能性氨基酸殘基，制備了失去了催化活性的變異體(catalytically inactive Cas13, dCas13)，保留了其特異性識(shí)別和結(jié)合靶向片段的特性，卻失去了內(nèi)切酶活性，這些發(fā)現(xiàn)使得研究者能夠利用dCas13進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)錄片段的結(jié)合并進(jìn)行后續(xù)RNA編輯[29]。目前發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物中含有3種腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR)，即ADAR1、ADAR2和ADAR3；RNA特異性ADAR能夠通過水解脫氨作用催化腺苷到肌苷的內(nèi)源性編輯[30]。Cox等[29]制備了一種RNA單堿基編輯工具，通過融合dCas13和ADAR2腺嘌呤脫氨酶活性域，實(shí)現(xiàn)腺苷到肌苷的RNA編輯目的，逆轉(zhuǎn)哺乳動(dòng)物中RNA水平突變導(dǎo)致的疾病。在此基礎(chǔ)上，Abudayyeh等[31]報(bào)道了一種由催化胞苷到尿苷的RNA編輯工具，可利用內(nèi)源性ADAR進(jìn)行RNA的編輯，將ADAR2轉(zhuǎn)化成胞苷脫氨酶，同時(shí)保留腺苷脫氨酶活性，提高RNA突變編輯數(shù)目，并且能夠?qū)崿F(xiàn)磷酸信號相關(guān)殘基的調(diào)控，該研究表明該系統(tǒng)能夠激活β-連環(huán)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞生長。許多RNA靶向編輯依賴于遞送外源性或化學(xué)修飾的向?qū)NAs，但需要克服遞送屏障及體內(nèi)免疫原性等問題。Qu等[32]引入一種利用內(nèi)源性ADAR進(jìn)行RNA程序性編輯的新型RNA單堿基編輯技術(shù)，應(yīng)用一段改造過的ADAR招募RNA(ADAR-recruiting RNAs, arRNAs)，招募機(jī)體自身ADAR1或ADAR2酶，實(shí)現(xiàn)胞苷到尿苷的編輯，編輯效率高達(dá)80%，并且具備高度特異性；該系統(tǒng)能夠恢復(fù)Hurler綜合征患者來源的原代成纖維細(xì)胞中α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性，且避免免疫反應(yīng)。

4 小結(jié)與展望

本文對Crispr/Cas13系統(tǒng)的特點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的敘述，總結(jié)了Crispr/Cas13系統(tǒng)在分子診斷及疾病治療中的作用。Crispr/Cas13系統(tǒng)原本是古生細(xì)菌和原核生物保護(hù)自身的防御系統(tǒng)，具有加工pre-crRNA成熟和crRNA介導(dǎo)的RNA靶向剪切的雙重核酸酶活性，但是在原核生物內(nèi)的混亂的“附帶剪切”效應(yīng)使其應(yīng)用受限，在使用時(shí)存在脫靶的可能性，存在一定的細(xì)胞毒性。但正是利用脫靶效應(yīng)，這種不被期待的“副作用”，開發(fā)了一系列用于診病診斷的工具，并且這種“附帶剪切”致休眠或程序性的凋亡的特性也被應(yīng)用于抗病毒及抗腫瘤等疾病治療，進(jìn)一步的探索證明憑借Cas13的“附帶剪切”效應(yīng)，結(jié)合多種工具，能夠?qū)崿F(xiàn)診療一體化平臺(tái)的搭建。當(dāng)前通過Cas13不同亞型篩選及Cas功能性蛋白殘基的改造，或結(jié)合其他RNA操縱酶，可以進(jìn)一步提高Cas13酶活性和特異性，改變Cas13酶功能，實(shí)現(xiàn)RNA敲除、編輯、示蹤等目的。Cas13多功能RNA調(diào)控平臺(tái)的發(fā)展對于深入研究RNA的功能，對于促進(jìn)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。