王雪亮，徐幸，魏萌，孔駿，肖艷群，周靖(上海市臨床檢驗中心分子生物學室，上海200126)

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase，PIK3CA)是Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶p110α催化亞基的編碼基因。作為PI3K-AKT-mTOR信號通路關(guān)鍵組成部分，PIK3CA基因突變會導致腫瘤患者對表皮生長因子受體等靶向藥物耐藥，從而使得治療效果不佳[1-2]。因此，治療前準確了解PIK3CA突變狀態(tài)，對指導腫瘤患者用藥并降低治療風險具有重要意義。

當前臨床上PIK3CA突變檢測常用方法有擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)、Sanger測序、高通量測序(next-generation sequencing，NGS)等。除了方法學眾多外，還有較多的實驗室自建方法，不同方法檢測結(jié)果可能存在差異。先前研究表明，實驗室間分子病理檢測項目結(jié)果一致性較差[3-5]，但目前尚未見PIK3CA突變檢測能力評估的報道。因此，本研究擬開展PIK3CA基因突變檢測的室間質(zhì)量評價，以期發(fā)現(xiàn)實驗室相關(guān)項目存在的問題，進一步改善和提高其檢測質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1樣本 室間質(zhì)評樣本購自菁良基因科技(深圳)公司，其通過基因編輯或者細胞篩選方法得到具有明確PIK3CA突變(H1047R、E545K、E542K)的細胞及野生型細胞，而后經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)制備而成。FFPE樣本經(jīng)微滴式數(shù)字PCR檢測，突變型樣本的突變比例約為50%。每支樣本管中放置1卷蠟片，組織厚度為15～20 μm，置于2～8 ℃保存。

1.2主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀、NanoDrop One超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Centrifuge 5424R高速離心機(德國Eppendorf公司)。人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)、FFPE DNA核酸提取試劑(廈門艾德生物醫(yī)藥科技公司)。

1.3室間質(zhì)評樣本的分析

1.3.1樣本DNA提取與檢測 取不同PIK3CA基因型FFPE樣本，使用FFPE DNA核酸提取試劑提取DNA，純化的DNA用NanoDrop One超微量分光光度計測定其濃度。將測定的DNA濃度稀釋至2.0 ng/μL，按照PIK3CA基因突變試劑盒及ABI 7500熒光定量PCR儀說明書操作進行檢測，以驗證不同PIK3CA樣本是否與預(yù)期基因型相符。

1.3.2均勻性評價 參照CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[6]中關(guān)于均勻性的評價要求，每批室間質(zhì)評樣本隨機抽取10支，采用PIK3CA基因突變試劑盒檢測，每支測定1次。

1.3.3穩(wěn)定性評價 在參評實驗室上報結(jié)果后3 d，隨機抽取2～8 ℃保存的各基因型室間質(zhì)評樣本6支，采用PIK3CA基因突變試劑盒檢測，每支測定1次，以評估其同步穩(wěn)定性。

1.4室間質(zhì)量評價的實施

1.4.1方案設(shè)計 2018年和2019年室間質(zhì)評樣本盤包括5支樣本，其中突變型樣本3～4支，野生型樣本1～2支。為防止參評實驗室串通數(shù)據(jù)，每套樣本盤的樣本進行隨機編號。

1.4.2組織形式 本項目室間質(zhì)評活動為自愿參加，上海市臨床檢驗中心作為CNAS認可的能力驗證提供者，樣本盤經(jīng)冷鏈運輸至各參評實驗室，不指定檢測方法，要求其在規(guī)定時間內(nèi)(自樣本接收2周內(nèi))用實驗室常規(guī)檢測系統(tǒng)檢測，結(jié)果通過網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)上報。

1.4.3結(jié)果評價 依據(jù)回報結(jié)果，按以下原則進行判定：野生型樣本不能檢出突變型，突變型樣本不能檢出野生型或其他突變型。參評實驗室室間質(zhì)評成績=符合的樣本數(shù)/總樣本數(shù)×100，100分為成績優(yōu)秀，80～99分為成績合格，小于80分為不合格。同時，計算各樣本的整體符合率、假陽性率和假陰性率。

2 結(jié)果

2.1室間質(zhì)評樣本驗證 對不同基因型FFPE樣本進行核酸抽提，經(jīng)分光光度法測得H1047R、E545K、E542K和野生型基因組DNA平均含量分別為905.7 ng、977.2 ng、829.8 ng和784.3 ng，可滿足不同突變檢測方法對樣本的需要量。ARMS檢測結(jié)果證實不同F(xiàn)FPE樣本均含有預(yù)期PIK3CA基因型，見圖1。

圖1 PIK3CA室間質(zhì)評樣本熒光PCR擴增曲線

2.2均勻性評價 隨機抽取的10支突變型FFPE樣本的檢測結(jié)果均為預(yù)期PIK3CA突變型，野生型FFPE樣本經(jīng)檢測無特異性擴增曲線，按照試劑盒結(jié)果判定規(guī)則判為野生型，表明室間質(zhì)評樣本的均勻性良好。

2.3穩(wěn)定性評價 參評實驗室上報結(jié)果后3 d檢測2～8 ℃保存的FFPE樣本，結(jié)果顯示均為預(yù)期PIK3CA基因型，表明該樣本在冷藏過程中具有良好穩(wěn)定性，可滿足室間質(zhì)評樣本傳遞要求。

2.4參評實驗室整體回報情況 2018年和2019年報名參加PIK3CA基因突變檢測室間質(zhì)評的實驗室分別為30家和22家，規(guī)定時間內(nèi)收到有效回報結(jié)果分別為28份和19份，有效回報率分別為93.3%和82.6%。2018年參評實驗室中8家為醫(yī)院病理科，20家為醫(yī)學檢驗所；2019年參評實驗室中6家為醫(yī)院病理科，13家為醫(yī)學檢驗所。

2次室間質(zhì)評活動中，參評實驗室中最常用方法為ARMS法(64.3%和73.7%)，其次為NGS(21.4%和15.8%)、Sanger測序(10.7%和5.3%)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)法(3.6%和5.3%)，見表1。

表1 參評實驗室所用方法和檢測能力

注：其他，指參評實驗室自建ARMS方法。

2.5室間質(zhì)評結(jié)果評價 按照結(jié)果評價原則，2018年22家實驗室(78.6%)回報結(jié)果完全正確(100分)，1家實驗室(3.5%)成績合格(80分)，5家實驗室(17.9%)成績不合格(<80分)；2019年17家實驗室(89.5%)回報結(jié)果完全正確(100分)，2家實驗室(10.5%)成績不合格(<80分)，見表1。

2次室間質(zhì)評活動中，2018年和2019年樣本的整體符合率為86.4%和93.7%。除2019年野生型樣本全部合格外，其余9支樣本均出現(xiàn)檢測不合格情況，其中1812(E545K)樣本符合率最低為82.1%。不合格結(jié)果中，2018年有4家實驗室出現(xiàn)12個假陽性結(jié)果，5家實驗室出現(xiàn)7個假陰性結(jié)果，其中2家實驗室各自檢測的5個樣本均不合格；2019年2個假陽性結(jié)果和4個假陰性結(jié)果均出自2家實驗室，其余實驗室回報結(jié)果全部正確，見表2。

表2 PIK3CA基因突變檢測樣本盤組成和室間質(zhì)評結(jié)果[%(n)]

3 討論

近些年來，針對特定靶點的分子靶向藥物越來越多地應(yīng)用于臨床，極大地改善了腫瘤患者預(yù)后并提高了其生存期。PIK3CA基因作為腫瘤靶向治療的重要預(yù)測因子，準確地檢測其突變狀態(tài)對于篩選合適的腫瘤患者進行靶向藥物治療至關(guān)重要。為全面評估臨床實驗室相關(guān)項目檢測質(zhì)量，本中心組織實施了PIK3CA基因突變檢測室間質(zhì)量評價。

兩次室間質(zhì)評結(jié)果顯示成績優(yōu)秀實驗室分別為78.6%和89.5%，這表明參評實驗室突變檢測能力短期內(nèi)得到較大提高，但仍有進步空間。與先前報道相一致[3-5]，假陽性和假陰性結(jié)果為主要錯誤類型，這將對腫瘤患者后續(xù)用藥造成極大不利影響。假陽性情況在2018年室間質(zhì)評中表現(xiàn)更為明顯，4家實驗室共計回報12個假陽性結(jié)果，其中1家實驗室出現(xiàn)5個錯誤突變的假陽性結(jié)果(均包含E545A突變)。推測其主要原因可能是人員操作(如交叉污染)或?qū)嶒炇椅廴?如氣溶膠)所致。因此，實驗室應(yīng)進一步強化人員培訓并嚴格采取分區(qū)操作的措施，且在檢測過程中需加入陰性質(zhì)控品，從而最大程度避免假陽性情況發(fā)生。2018年室間質(zhì)評后參評實驗室通過針對性整改，2019年室間質(zhì)評假陽性結(jié)果大幅降低(僅2個)也進一步證明了上述結(jié)論。兩次室間質(zhì)評的假陰性率分別為8.3%和5.3%，變化幅度不大。但63.6%(7/11)的假陰性結(jié)果是由實驗室自建方法(Sanger測序和ARMS法)回報，這可能和實驗室未對其進行充分的性能確認相關(guān)[7]。其他假陰性結(jié)果可能為人員操作不當導致，如DNA抽提得率低、錯加或漏加樣本等。但需指出的是，兩次室間質(zhì)評中實驗室間錯誤情況重復性低，不同檢測方法和突變檢測的錯誤情況無直接相關(guān)性。

不同樣本類型可用于分子病理項目的室間質(zhì)評活動中，包括患者組織樣本、質(zhì)粒DNA、細胞系等[8]。其中細胞系制備的FFPE樣本具有易于大批量制備、穩(wěn)定性好、可充分模擬臨床樣本進行檢測全程監(jiān)控等優(yōu)點。此外，還可將突變型和野生型細胞系進行不同比例混合，從而制備含有不同突變比例的FFPE樣本[9]。因此，本研究選用細胞系制備的突變比例約為50%的FFPE樣本，包含臨床最為常見的E542K、E545K和H1047R 3種熱點突變[10]。其均勻性和穩(wěn)定性良好，可替代臨床組織樣本用于PIK3CA基因突變檢測能力的評估?？紤]當前臨床樣本多為小活檢或細胞學樣本，今后室間質(zhì)評中還需適當降低每張切片的腫瘤細胞數(shù)量，以更好滿足臨床小樣本的突變檢測需求。

綜上所述，本研究結(jié)果表明大部分實驗室PIK3CA突變檢測能力良好，但部分實驗室檢測能力尚需提高。室間質(zhì)量評價可改進并提高臨床實驗室檢測質(zhì)量，從而為臨床合理靶向用藥提供更為有效地指導和幫助。此外，本次室間質(zhì)評主要針對分析中過程，今后我們也將重點對PIK3CA突變的分析前(如腫瘤細胞比例)和分析后(如報告闡述)過程進行評估，以便更加全面地評價臨床實驗室的檢測能力。