石旦,徐斌,蔣敬庭(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，蘇州大學(xué)細(xì)胞治療研究院，江蘇常州213003)

目前已有多種針對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)特別是晚期NSCLC的分子靶向藥物。但對于特定突變位點之外的NSCLC患者[1]，仍迫切需要新的治療靶點。本研究建立了一種基于預(yù)后價值的篩選生物標(biāo)志物的方法，同時考慮候選基因在NSCLC良惡性組織中的表達(dá)差異，最終選取母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(MELK)作為研究對象。MELK又名小鼠蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶38(MPK38)[2]，是一種AMPK相關(guān)的絲氨酸—蘇氨酸激酶，在不同物種間高度保守[3]。在正常組織中，MELK僅在睪丸中表達(dá)，其在胸腺和小腸中的表達(dá)水平非常低[4]。MELK最初被鑒定為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，作為細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)物發(fā)揮重要作用，并影響各種細(xì)胞和生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡、剪接體組裝、基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、造血和腫瘤發(fā)生等[3]。MELK可被不同外源性刺激激活，包括H2O2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、硫精氨酸、離子霉素、TGF-β1、5-氟尿嘧啶(5FU)和阿霉素(DOX)等，它們可觸發(fā)ASK1，TGF-β和p53信號通路[5]。此外，研究證實MELK具有廣泛的底物特異性。可通過磷酸化激活MAP3K5/ASK1，以激活細(xì)胞凋亡，也可通過介導(dǎo)CDC25B的磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[6]，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和致癌。雖然MELK在其他腫瘤中已有相關(guān)研究[7-8]，但在NSCLC預(yù)后判斷中的作用尚未明晰。本研究基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫等公開的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，旨在闡明MELK在NSCLC中的預(yù)后價值。

1 材料和方法

1.1數(shù)據(jù)檢索方法 以“肺癌”為關(guān)鍵詞檢索腫瘤基因組圖譜計劃(TCGA)和基因表達(dá)譜(GEO數(shù)據(jù)庫)，并制定檢索策略，檢索流程見圖1。研究類型設(shè)置為“expression profiling by array”，條目類型設(shè)置為“datasets”。所有入選數(shù)據(jù)集的樣本量≥50。數(shù)據(jù)集必須包括必要信息，如生存信息、人口學(xué)特征、腫瘤分期和治療信息等。數(shù)據(jù)庫檢索由兩名研究人員獨立進(jìn)行，并對有異議的數(shù)據(jù)集進(jìn)行討論并最終達(dá)成共識。

1.2數(shù)據(jù)采集與處理 由兩名研究人員獨立提取所有納入數(shù)據(jù)集中的信息。對于入選的芯片及測序數(shù)據(jù)，采用基于R軟件(3.5.0版本)的循環(huán)算法計算每個數(shù)據(jù)集中基因的HR值，篩選具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的基因及其HR值，各個結(jié)果數(shù)據(jù)依據(jù)基因名進(jìn)行匹配。根據(jù)HR值計算得出2個指標(biāo)：HRh和HRl，其中HRh定義為數(shù)據(jù)集中所有大于1.0的HR值總數(shù);HRl定義為數(shù)據(jù)集中所有小于1.0的HR值總數(shù)。分析流程見圖2。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程

圖2 基因篩選分析流程

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 使用R3.5.0(R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria)和GraphPad Prism 5.0軟件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組或兩組以上均值的比較采用t檢驗和單因素方差分析。生存曲線采用Kaplan-Meier法并進(jìn)行Log-Rank檢驗。用單因素和多因素Cox模型計算MELK的HR值及其95%CI以評價其對預(yù)后的影響。通過CochranQ和I2檢驗評價基于MELKmRNA水平的各個數(shù)據(jù)集結(jié)果的異質(zhì)性。當(dāng)I2>50%或P<0.1時采用隨機效應(yīng)模型(Dersimonian-Laird法)，其他采用固定效應(yīng)模型(Mante-Haenszel法)。

2 結(jié)果

2.1研究特征 通過關(guān)鍵詞檢索從GEO數(shù)據(jù)庫中初篩選出779個潛在相關(guān)數(shù)據(jù)集。通過樣本大小和組織類型篩選后，共獲取680個數(shù)據(jù)集。根據(jù)數(shù)據(jù)摘要和臨床參數(shù)，最終從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得7個相關(guān)研究(GSE14814[9]、GSE30219[10]、 GSE37745[11]、GSE42127[12]、GSE50081[13]、 GSE68465[14]、 GSE68571[15])，包括TCGA數(shù)據(jù)庫中獨立的肺腺癌、肺鱗癌數(shù)據(jù)，最后納入8個腺癌和6個鱗癌數(shù)據(jù)集，包括1 536例肺腺癌和739例肺鱗癌患者。所有納入數(shù)據(jù)集的基線特征見表1。

表1 納入數(shù)據(jù)集的基線特征

注：LUAD，肺腺癌; LUSC，肺鱗癌; NR，未報道; OS，總生存期。

2.2預(yù)后相關(guān)基因篩選 基于循環(huán)算法，計算選定數(shù)據(jù)集中所有基因的HR值，并計算HRh和HRl指標(biāo)。在LUAD數(shù)據(jù)集中，排列前5位且提示預(yù)后良好的基因為CAT、FRZB、CTSH、PBXIP1、NPC2，提示預(yù)后不良的基因為TK1、INPP4B、TTK、MELK、NPAS2。在LUSC數(shù)據(jù)集中，排列前5位且提示預(yù)后良好的基因分別為ARMCX6、C3orf58、CYB5R2、DGKA、DUSP9，提示預(yù)后不良的前5位基因是ABCC3、ALDH7A1、ERBB2、FTO、HTR1D。見表2、3。此外，考慮基因在不同組織中的表達(dá)水平，TK1、TTK和MELKmRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，而INPP4B、NPAS2在腫瘤組織中的表達(dá)水平與正常組織相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 LUAD患者預(yù)后相關(guān)基因的篩選

表3 LUSC患者預(yù)后相關(guān)基因的篩選

2.3MELKmRNA在腫瘤、正常組織及不同病理分期中的表達(dá) 在TCGA LUAD數(shù)據(jù)中，MELKmRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織(t=24.906，P<0.001，圖3A)，且從Ⅰ～Ⅳ期逐漸升高(F=3.779，P=0.011，圖3B)。與LUAD結(jié)果相似，在LUSC數(shù)據(jù)中MELKmRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平亦明顯高于正常組織(t=26.401，P<0.001，圖3C)，且從Ⅰ～Ⅳ期逐漸升高(F=4.195，P=0.002，圖3D)。

注：A，正常對照及肺腺癌組織中MELKmRNA表達(dá); B，肺腺癌不同分期MELKmRNA表達(dá); C，正常對照及肺鱗癌組織中MELKmRNA表達(dá); D，肺鱗癌不同分期MELKmRNA表達(dá)

圖3 不同腫瘤組織及不同病理分期的MELKmRNA表達(dá)水平

2.4MELKmRNA表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 對NSCLC各數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行單因素和多因素Cox模型分析。LUAD和LUSC患者各數(shù)據(jù)集中MELKmRNA的P值、HR值和95%CI值見表4和表5，LUAD和LUSC患者各數(shù)據(jù)集的生存曲線見圖4和圖5。

表4 肺腺癌數(shù)據(jù)集Cox模型分析結(jié)果

表5 肺鱗癌數(shù)據(jù)集Cox模型分析結(jié)果

注：A，GSE30219；B，GSE37745；C，GSE42127；D，GSE50081；E，GSE68465；F，GSE14814；G，GSE68571；H，TCGA。

注：A，GSE30219；B，GSE37745；C，GSE42127；D，GSE50081；E，GSE14814；F，TCGA。

2.5對LUAD和LUSC患者進(jìn)行MELK影響預(yù)后的聯(lián)合分析 對LUAD的Cox多因素生存分析結(jié)果效應(yīng)量進(jìn)行meta合并，異質(zhì)性檢驗顯示其無明顯的統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性(I2=0.0%,P=0.562)，故而采用固定效應(yīng)模型合并HR值。結(jié)果顯示，MELKmRNA高表達(dá)與較低的總生存率(OS)顯著相關(guān)(合并HR=2.162，95%CI:1.796～2.604)，結(jié)果見圖6A。對LUSC的Cox多因素生存分析結(jié)果效應(yīng)量進(jìn)行meta合并，異質(zhì)性檢驗顯示存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性(I2=67.1%,P=0.009)，故采用隨機效應(yīng)模型合并HR值。結(jié)果顯示LUSC患者M(jìn)ELKmRNA和OS之間無顯著關(guān)聯(lián)(合并HR=1.304;95%CI:0.953～1.786)，結(jié)果見圖6B。

圖6 肺腺癌和肺鱗癌患者多因素生存分析的森林圖

3 討論

近年來NSCLC發(fā)病率和死亡率在各類腫瘤中均居于前列，嚴(yán)重威脅著人類健康。因此，尋找新的生物標(biāo)志物對NSCLC的診斷和治療具有重要意義。目前同類研究較少，Piao等[16]基于GEO數(shù)據(jù)利用GEO2R功能尋找差異表達(dá)基因，并通過STRING、Cytoscape和MCODE構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，以篩選關(guān)鍵基因。該方法主要基于基因表達(dá)差異，而本研究所采用的方法主要基于預(yù)后價值。與上述網(wǎng)站檢索方法相比，本研究方法存在以下幾點差異：首先，本研究基于每個獨立的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，是基于較少的樣本量得出的結(jié)果，合并后更加穩(wěn)健。通常在科研設(shè)計中，組間期望差異越小，所需總樣本量越大，反之，樣本量越大，越易得到顯著的結(jié)果，同時也意味著較高的假陽性率。其次，HRh和HRl可用來判斷其相應(yīng)基因的預(yù)后價值。結(jié)合HRh和HRl具體數(shù)值有助于明確基因的預(yù)后價值，即HRh值越高，同時HRl值越低，表明該基因為NSCLC患者的高風(fēng)險基因;呈相反趨勢則表明該基因?qū)SCLC患者的保護(hù)作用越強，因此保證了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。Li等[17]采用WGCNA分析法鑒定肺腺癌中與生存相關(guān)的表達(dá)模塊，其從識別的模塊中，獲取了3個關(guān)鍵基因UBE2C，TPX2和MELK，這一過程主要是通過生物信息方法并基于單個數(shù)據(jù)集來實現(xiàn)的。

在本研究中，LUAD和LUSC患者腫瘤組織中MELKmRNA表達(dá)水平明顯高于正常組織，且從Ⅰ～Ⅳ期逐漸升高。有研究顯示，MELK在多種癌癥中表達(dá)升高，包括乳腺癌、肝癌、胃癌、急性髓系白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎癌等[7,18-20]。此外，MELKmRNA的高表達(dá)與LUAD患者預(yù)后不良相關(guān)，這與Speers等[21]和Kuner等[8]在乳腺癌和前列腺癌患者中的研究結(jié)果相似。本研究中，LUSC數(shù)據(jù)集的總HR值顯示無統(tǒng)計學(xué)意義，但它仍然揭示了一種趨勢，即MELK高表達(dá)與LUSC患者的不良預(yù)后可能相關(guān)。這種預(yù)后差異可能歸因于肺腺癌及鱗癌不同的組織學(xué)特征、不同的治療手段以及對治療手段的反應(yīng)率的差異造成的。本研究是基于公共數(shù)據(jù)的挖掘研究，由于不同數(shù)據(jù)產(chǎn)生于不同的檢測平臺，包括基因芯片和測序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)存在一定的異質(zhì)性，本研究的結(jié)果還有待更高級別證據(jù)的研究進(jìn)一步證實。綜上所述，MELKmRNA在肺腺癌中的表達(dá)水平越高其預(yù)后越差，MELK有望成為肺腺癌患者治療的潛在的分子靶點。