劉 玲 劉思佳 劉 洋 湯其群

（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 上海 200032）

脂肪組織是一種重要的能量代謝器官，當(dāng)機(jī)體攝入能量大于消耗能量，多余的能量會(huì)以甘油三酯的形式儲(chǔ)存在脂肪組織中［1］。脂肪組織過(guò)多會(huì)引發(fā)肥胖、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病，對(duì)公眾健康造成了巨大威脅。人體有3 種脂肪組織，分別是白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT），棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）和米色脂肪組織（beige adipose tissue）［2］。WAT 可以將多余的能量以甘油三酯的形式儲(chǔ)存，而BAT 中含有較多線粒體，通過(guò)解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）將跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子勢(shì)能與ATP 解偶聯(lián)，將能量轉(zhuǎn)化為熱能，從而起到產(chǎn)熱和消耗能量的作用［3］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境誘導(dǎo)下小鼠腹股溝皮下白色脂肪會(huì)產(chǎn)生功能、形態(tài)類似于棕色脂肪的細(xì)胞，內(nèi)含許多線粒體和小脂滴，能夠高表達(dá)UCP1，和棕色脂肪細(xì)胞一樣能夠促進(jìn)脂肪組織代謝產(chǎn)熱。但其與傳統(tǒng)棕色脂肪細(xì)胞的前體起源不同，因此被命名為米色脂肪細(xì)胞［4］。二者被統(tǒng)稱為產(chǎn)熱性脂肪組織。自此，研究者對(duì)于米色脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)激活產(chǎn)生了極大的興趣，其可作為對(duì)抗肥胖的新型靶細(xì)胞。

UCP1 特異性表達(dá)于BAT 的線粒體中［5］，是成熟棕色脂肪特異性的產(chǎn)熱基因［6］。白色脂肪細(xì)胞被誘導(dǎo)為米色脂肪細(xì)胞后高表達(dá)UCP1。實(shí)驗(yàn)中往往將UCP1 作為重要的標(biāo)志物來(lái)研究脂肪組織的產(chǎn)熱功能。棕色、米色脂肪細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜上有UCP1 質(zhì)子通道，通過(guò)線粒體內(nèi)膜來(lái)消散質(zhì)子梯度，使質(zhì)子回流，破壞電子傳遞中的跨膜電化學(xué)梯度，物質(zhì)氧化和ATP 生成解偶聯(lián)，ATP 合成受到抑制，能量會(huì)以熱量的形式散發(fā)出去。UCP1 在體溫維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體的交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生興奮，如受到冷刺激的誘導(dǎo)時(shí)［7］，棕色和米色脂肪組織的產(chǎn)熱功能被激活，可以被用于治療肥胖、糖尿病等代謝性疾?。?］。冷刺激誘導(dǎo)下，腹股溝皮下WAT 中UCP1 表達(dá)明顯上調(diào)［9］，使其出現(xiàn)BAT 的典型特點(diǎn)，增加產(chǎn)熱和能量消耗［10］。

由于傳統(tǒng)的減肥藥具有不良反應(yīng)，未達(dá)到理想的臨床效果。因此，篩選出新型基因來(lái)誘導(dǎo)激活棕色脂肪產(chǎn)熱有助于改善機(jī)體代謝和減輕肥胖程度，具有良好的研究前景。本課題組致力于研究脂肪細(xì)胞發(fā)育分化及代謝調(diào)控機(jī)制，篩選在脂肪組織產(chǎn)熱過(guò)程發(fā)揮重要作用的蛋白。此前，課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在冷刺激誘導(dǎo)后的腹股溝皮下WAT中篩選，發(fā)現(xiàn)PAQR9 的表達(dá)水平顯著升高，推測(cè)其可能在激活脂肪組織產(chǎn)熱過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)對(duì)PAQR9 的研究非常少見(jiàn)，對(duì)其在該過(guò)程中的功能進(jìn)行初步探索，可以為肥胖等疾病治療提供新的理論依據(jù)。

本研究中，我們首先檢測(cè)了PAQR9 在小鼠脂肪組織中的表達(dá)情況及冷暴露刺激條件下脂肪組織和腹股溝皮下WAT 成熟脂肪細(xì)胞中PAQR9 的表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。再利用前棕色脂肪細(xì)胞系DE2-3 和間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2 為模型開(kāi)展研究，通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和敲低PAQR9 基因，探討該基因?qū)ψ厣井a(chǎn)熱及UCP1表達(dá)的影響。

材料和方法

儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；PCR 儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf 公司；蛋白質(zhì)印跡電泳槽等購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)于美國(guó)GE 公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf AG 公司；Milli-q 超純水系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó)Millipore 公司。

主要試劑DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；UCP1 抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；HSP90 抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；SYBR Green reagent 購(gòu)于美國(guó)ABI 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa 公司；ECL 發(fā)光液購(gòu)于上海圣爾生物有限公司；三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、無(wú)水乙醇均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；BCA 定量試劑盒、opti-MEM 培養(yǎng)基、蛋白Marker 購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；Trizol 和lipofectamine RNAiMAX 試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；PBS 試劑購(gòu)于以色列BI 公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、三碘甲狀腺氨酸（T3）、吲哚美辛、羅格列酮、油紅O 購(gòu)于美國(guó)Sigma-Alderich 公司；胰島素、蛋白酶抑制劑購(gòu)于瑞士Roche 公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57BL/6J 小鼠購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物中心，小鼠置于SPF 級(jí)動(dòng)物房，在（22±2）℃，相對(duì)濕度55%±5%的環(huán)境中飼養(yǎng)。維持12/12 h 光/暗循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

處死取材將動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后處死，取5只雄性C57BL/6J 小鼠BAT、附睪內(nèi)臟WAT 及腹股溝皮下WAT，速凍于液氮中。

前棕色脂肪細(xì)胞系DE2-3 培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)室前期獲得了永生化的前棕色脂肪細(xì)胞系［11］（美國(guó)麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院王永旭博士及復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院潘東寧教授惠贈(zèng)），按照下述標(biāo)準(zhǔn)法可誘導(dǎo)其分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫37 ℃，含有5%CO2。在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，每2 天給細(xì)胞換1 次液，傳代后接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿。鏡下觀察貼壁細(xì)胞密度占視野70%時(shí)記為第2 天（day-2），培養(yǎng)基中加入三碘甲狀腺氨酸和胰島素，混勻后給細(xì)胞換液；2 天后細(xì)胞密度達(dá)到100%，記為第0 天（day 0），在DMEM 中加入0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.5 μmol/L 地塞米松，0.125 mmol/L吲哚及1 μg/mL 胰島素，搖勻后換液；在第2 天（day 2）和第4 天（day 4），操作同第-2 天（day -2），補(bǔ)加三碘甲狀腺氨酸和胰島素，混勻后給細(xì)胞換液，鏡下觀察到細(xì)胞的脂滴逐漸增多；第6 天（day 6），可以觀察到鏡下布滿脂滴，誘導(dǎo)分化結(jié)束，收取細(xì)胞樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

C3H10T1/2 細(xì)胞系培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2 購(gòu)于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞系是科學(xué)家于1973 年由14～17 日齡C3H 小鼠胚胎中分離出來(lái)［12］，細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞形態(tài)。Tang等［13］研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞模型可以定向誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫37 ℃，含有5%CO2。在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，每2 天換1 次液，傳代后接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿。細(xì)胞接觸抑制2 天后開(kāi)始誘導(dǎo)分化，記為第0 天（day 0），在DMEM 培養(yǎng)基中加入1 μg/mL 胰島素、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和1 μmol/L 羅格列酮誘導(dǎo)48 h。第2 天（day 2）時(shí)更換培養(yǎng)基，補(bǔ)加1 μmol/L羅格列酮和1 μg/mL 胰島素繼續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞48 h。在第4 天（day 4）給細(xì)胞更換含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，不補(bǔ)加藥物。直至第6 天（day 6）脂肪細(xì)胞分化成熟。

構(gòu)建過(guò)表達(dá)腺病毒設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，PCR 得到兩端帶有酶切位點(diǎn)的基因。酶切回收得到目的片段和載體，將回收的產(chǎn)物相連接；擴(kuò)增連接產(chǎn)物，測(cè)序以驗(yàn)證序列；LR 重組及PacⅠ酶切；將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至HEK 293A 工具細(xì)胞中包裝病毒。向培養(yǎng)皿中加入LacZ 病毒（對(duì)照組）和PAQR9病毒各（實(shí)驗(yàn)組）60 μL 感染DE2-3 細(xì)胞，24 h 后更換為含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至脂肪細(xì)胞分化成熟。

小干擾RNA 100 μL opti-MEM 中加入6 μL 3.5 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿用量的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），根據(jù)所需用量配齊總管，輕輕吹打混勻，記為管1。再取另一EP 管加入100 μL opti-MEM 及6 μL轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine RNAiMAX（3.5 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿用量），根據(jù)所需用量配齊總管，輕輕吹打混勻，記為管2，管1、管2 靜置3 min，將管2溶液緩緩滴加到管1 中，反復(fù)吹打5 次，混勻后靜置20 min。將細(xì)胞上清培養(yǎng)基傾倒，換為2 mL opti-MEM。將靜置的siRNA 緩緩加到細(xì)胞，每個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿加入200 μL siRNA。24 h 后傾倒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，換成含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，在轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。siNC 為對(duì)照組，siPAQR9 1-3 為實(shí)驗(yàn)組。siRNA 序列如下：NC 上游引物序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACG-UTT-3’，NC 下游引物序列ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；siPAQR9-1 上游引物序列5’-GCUGCCGCUGUGGUGCUAUTT-3’，siPAQR9-1 下游引物序列5’-AUAGCACCACAGCGGCAGCTT-3’；siPAQR9-2 上游引物序列5’-GCCUUCUUCUACCUGGACUTT-3’，siPAQR9-2下游引物序列5’-AGUCCAGGUAGAAGAAGGCTT-3’；siPAQR9-3 上游引物序列5’-GCACCUUCGUCUUCGUCAUTT-3’，siPAQR9-3 下游引物序列5’-AUGACGAAGACGAAGGUGCTT-3’。

液態(tài)氧電極檢測(cè)細(xì)胞氧氣消耗按照說(shuō)明書安裝氧電極（YSI model 5300A），KCl 溶液作為電解液，連接線路接通電源。在電腦軟件中校正，清洗反應(yīng)室，將細(xì)胞用700 μL 胰酶消化，再加入700 μL緩沖液終止消化。500×g離心2 min，棄上清，用700 μL 緩沖液重懸細(xì)胞。加入機(jī)器中，觀察耗氧曲線，記錄數(shù)值。緩沖液配置方法：PBS 溶液中加入25 mmol/L 葡萄糖，1 mmol/L 丙酮酸鈉和2% BSA。每個(gè)3.5 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入700 μL 緩沖液。

RNA 制備和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)利用Trizol 法提取細(xì)胞及組織中的RNA，測(cè)定RNA 濃度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列如下：18SrRNA 上游引物序列5’-CGCCGCTAGAGGTGAAATTCT-3’，18SrRNA下游引物序列5’-CATTCTTGGCAAATGCTTTCG-3’；PAQR9 上游引物序列5’-GGACTACGCTTCCATCAGCTA-3’，PAQR9 下游引物序列5’-CAGTCGGTGCGGCTCTTAC-3’；UCP1 上游引物序列5’-AGGCTTCCAGTACCATTAGGT-3’，UCP1 下游引物序列5’-CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT-3’；Adipoq 上游引物序列5’-TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA-3’，Adipoq 下游引物序列5’-CCAACCTGCACAAGTTCCCTT-3’；Fabp4 上游引物序列：5’-CCTTTGTGGGAACCTGGAA-3’，F(xiàn)abp4 下游引物序列5’-CTGTCGTCTGCGGTGATT-3’；PPARγ 上游引物序列5’-GTGCCAGTTTCGATCCGTAGA-3’，PPARγ 下游引物序列5’-GGCCAGCATCGTGTAG-TGA-3’。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞和組織蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品加入上樣孔，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再經(jīng)過(guò)PVDF 膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，在4 ℃冰箱中搖床上用特異性的一抗孵育，過(guò)夜。孵育與之對(duì)應(yīng)的二抗，持續(xù)1 h。洗膜5 次后，用ECL 發(fā)光液發(fā)光顯影。

油紅O 染色稱量0.5 g 油紅O 粉末，溶于100 mL 異丙醇，搖床過(guò)夜搖勻后制備為貯存液。油紅O貯存液與蒸餾水比例為3∶2混合搖勻，轉(zhuǎn)速1 000×g，離心5 min，棄去管底沉淀，濾紙過(guò)濾3 次，制備成油紅O 工作液。脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟后，將細(xì)胞棄去DMEM 培養(yǎng)液，用PBS 清洗2～3 次，3.7%甲醛固定細(xì)胞20 min 后用水清洗，每個(gè)3.5 cm 培養(yǎng)皿加入2 mL 油紅O 工作液，染色2 h 以上。染色結(jié)束后用水清洗油紅，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入少量蒸餾水，鏡下觀察及拍照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0 分析處理，數(shù)據(jù)分析均為兩組結(jié)果之間相比較，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)結(jié)果用表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

小鼠BAT 和WAT 及冷刺激后PAQR9 的mRNA水平變化取C57BL/6 雄性小鼠肩胛間區(qū)BAT、腹股溝皮下白色脂肪組織（inguinal WAT，iWAT）和附睪內(nèi)臟白色脂肪組織（epididymal WAT，eWAT）用于實(shí)驗(yàn)研究（圖1A）。檢測(cè)以上不同位置脂肪組織中PAQR9 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)BAT 中PAQR9 的mRNA 水平顯著高于WAT（P＜0.001，圖1B），這提示PAQR9 可能在BAT 中發(fā)揮重要功能。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3 種溫度條件，分別是在4 ℃冷暴露（cold）、室溫（RT）和30 ℃熱中性（warm）環(huán)境下，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與室溫條件相比，BAT 和iWAT 在冷刺激誘導(dǎo)下PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（BAT：P＜0.001，iWAT：P＜0.01，圖 1C），而eWAT 在冷刺激誘導(dǎo)下PAQR9 的mRNA 水平變化不明顯（圖1C）。相較于室溫條件，在冷刺激誘導(dǎo)下的iWAT 中提取出的成熟脂肪細(xì)胞中PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.001，圖1D）。以上結(jié)果提示，PAQR9 在冷刺激誘導(dǎo)脂肪組織產(chǎn)熱的過(guò)程中可能扮演重要角色。

圖1 小鼠BAT 和WAT 及冷刺激后PAQR9 的mRNA 水平變化Fig 1 The mRNA level of PAQR9 from BAT and iWAT from C57BL/6 mice after cold stimulation

DE2-3 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PAQR9 對(duì)成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響將前棕色脂肪細(xì)胞系DE2-3通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)法誘導(dǎo)分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞。分別取第-2、0、2、4、6 天的細(xì)胞，檢測(cè)PAQR9 的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)第6 天時(shí)PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.001，圖2A），推測(cè)PAQR9 在棕色脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中可能發(fā)揮功能。構(gòu)建過(guò)表達(dá)PAQR9 的腺病毒感染DE2-3 細(xì)胞，成功過(guò)表達(dá)PAQR9（P＜0.001，圖2B）。過(guò)表達(dá)PAQR9 后，DE2-3 細(xì)胞中產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.01，圖2C）。通過(guò)液態(tài)氧電極測(cè)量氧氣消耗量，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PAQR9 后耗氧量增加（P＜0.01，圖2D），說(shuō)明過(guò)表達(dá)PAQR9 可以增加氧氣的消耗，促進(jìn)細(xì)胞代謝功能。同時(shí)，探究PAQR9 是否對(duì)細(xì)胞的成脂分化能力有影響。在成脂誘導(dǎo)分化后第7 天收取細(xì)胞樣品，過(guò)表達(dá)PAQR9 病毒的實(shí)驗(yàn)組與過(guò)表達(dá)LacZ 病毒的對(duì)照組相比，成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂聯(lián)素（adiponectin/Adipoq）和脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP4）的mRNA 水平?jīng)]有顯著性差異（圖2E）。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色，肉眼觀察和鏡下觀察（比例尺50 μm）并拍照，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的油紅染色率相當(dāng)（圖2F、2G）。說(shuō)明過(guò)表達(dá)PAQR9 不影響DE2-3 細(xì)胞的成脂分化功能，可以促進(jìn)細(xì)胞氧氣消耗，使產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平升高。

DE2-3 細(xì)胞中敲低PAQR9 抑制產(chǎn)熱基因UCP1的mRNA 水平將前棕色脂肪細(xì)胞系DE2-3 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)法誘導(dǎo)分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞。設(shè)計(jì)了3 條siRNA 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，成功將PAQR9 在DE2-3 細(xì)胞中敲低（P＜0.001，圖3A）。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DE2-3 細(xì)胞在敲低PAQR9 之后UCP1 mRNA 水平顯著下調(diào)（P＜0.001，圖3B）。

C3H10T1/2 細(xì)胞中敲低PAQR9 對(duì)成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2能夠在誘導(dǎo)劑作用下分化為成熟脂肪細(xì)胞［14］。在C3H10T1/2 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，取第0、2、4、6 天的細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在第4～6 天脂肪細(xì)胞分化成熟時(shí)PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.001，圖4A）。設(shè)計(jì)了2 條siRNA，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siPAQR9-2 將基因敲低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C3H10T1/2 細(xì)胞在敲低PAQR9 之后UCP1的蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)（圖4C）。以上結(jié)果表明，敲低PAQR9 會(huì)抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色，肉眼觀察并拍照，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的油紅染色率相當(dāng)（圖4D），說(shuō)明敲低PAQR9 不影響C3H10T1/2 細(xì)胞的成脂分化功能。

圖2 DE2-3 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PAQR9 對(duì)成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響Fig 2 The effect on adipogenesis and thermogenesis gene UCP1 after the overexpression of PAQR9 in DE2-3 cells

圖3 DE2-3 細(xì)胞中敲低PAQR9 抑制產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平Fig 3 The mRNA level of thermogenesis gene UCP1 after knocking down PAQR9 in DE2-3 cells

討論

隨著生活水平提高、社會(huì)環(huán)境改變及遺傳等多方面因素的影響，人們攝入體內(nèi)的能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其消耗量，導(dǎo)致了能量不平衡［15］，進(jìn)一步誘發(fā)肥胖等疾病，給患者及其家庭和社會(huì)帶來(lái)痛苦和沉重負(fù)擔(dān)，已然成為科學(xué)界密切關(guān)注的問(wèn)題。遺憾的是，傳統(tǒng)的治療方法效果不能令人滿意［16］。

圖4 C3H10T1/2 細(xì)胞中敲低PAQR9 對(duì)成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響Fig 4 The effect on adipogenesis and thermogenesis gene UCP1 after knocking down PAQR9 in C3H10T1/2 cells

棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)存在多個(gè)小脂滴，含有大量線粒體，便于其吸收、利用葡萄糖和脂肪酸等能量供應(yīng)物質(zhì)［17］。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)線粒體中UCP1 將能量轉(zhuǎn)化為熱能，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)態(tài)。正因?yàn)樽厣揪哂挟a(chǎn)熱功能，已然成為了當(dāng)下治療代謝性疾病的潛在靶點(diǎn)之一。米色脂肪則與傳統(tǒng)的棕色脂肪來(lái)源不同，但它們都是產(chǎn)熱性脂肪，能夠在寒冷刺激等因素誘導(dǎo)下激活產(chǎn)熱功能，具有消耗多余能量的潛力。產(chǎn)熱性脂肪的功能調(diào)節(jié)成為了代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，科研人員試圖以此為突破口篩選出能夠促進(jìn)產(chǎn)熱功能的基因，開(kāi)發(fā)出健康有效的新一代肥胖治療方法［18］。

UCP1 是成熟棕色脂肪細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，同時(shí)也是白色脂肪棕色化激活的表現(xiàn)。在低溫環(huán)境下，哺乳動(dòng)物會(huì)發(fā)生顫栗，通過(guò)產(chǎn)熱來(lái)維持體溫恒定，而后會(huì)轉(zhuǎn)變成利用棕色脂肪組織進(jìn)行非顫栗性產(chǎn)熱，線粒體內(nèi)膜的UCP1 則是決定BAT 產(chǎn)熱功能的關(guān)鍵因素。而在熱中性條件下，無(wú)需額外消耗能量即可維持生理活動(dòng)。冷暴露是一種非顫抖性產(chǎn)熱的強(qiáng)刺激因子，實(shí)驗(yàn)經(jīng)常在冷暴露誘導(dǎo)的條件下開(kāi)展，探究激活產(chǎn)熱脂肪發(fā)揮作用的機(jī)制［19］。

既往研究發(fā)現(xiàn)，6 周齡大小的C57BL/6 小鼠BAT 中Zfp516 的mRNA 水平顯著高于WAT。相比于室溫條件，在4 ℃冷暴露刺激下BAT 中的Zfp516 和UCP1 蛋白質(zhì)水平顯著上調(diào)，從而促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)熱［20］。還有文獻(xiàn)報(bào)道，在4℃條件下BAT中JAK2 基因蛋白質(zhì)水平上調(diào)，而在WAT 中變化不明顯，且UCP1 的mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平都顯著上調(diào)［21］。篩選出調(diào)控棕色脂肪產(chǎn)熱功能的新型基因?qū)τ谥委煼逝值却x性疾病具有深遠(yuǎn)意義。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在冷暴露誘導(dǎo)下腹股溝皮下WAT 中PAQR9 表達(dá)上調(diào)，結(jié)合前人的研究經(jīng)驗(yàn)，我們推測(cè)PAQR9 可能在棕色脂肪產(chǎn)熱過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。PAQRs 共有11 個(gè)家族成員，具有7 次跨膜結(jié)構(gòu)，特有1 個(gè)PFAM-UPF0073 結(jié)構(gòu)域。該家族成員分為3 個(gè)亞群：PAQR1-PAQR4 屬于脂聯(lián)素受體，能夠在葡萄糖攝取及脂肪酸代謝方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；孕激素膜蛋白受體為PAQR5-PAQR9；此外，還有溶血素受體即PAQR10 和PAQR11［22］。PAQR 蛋白家族發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)功能，在細(xì)胞凋亡、脂肪酸氧化、性激素調(diào)控等方面發(fā)揮作用［23］。然而近年來(lái)對(duì)PAQR9 的研究非常少，僅有報(bào)道其在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制方面的作用［24］，其功能尚未被完全闡明，且在脂肪代謝領(lǐng)域未見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)PAQR9 可能在脂肪代謝產(chǎn)熱過(guò)程中扮演一定角色，進(jìn)一步探索將為治療相關(guān)代謝性疾病提供新型靶標(biāo)。

為了進(jìn)一步探究PAQR9 基因在脂肪代謝產(chǎn)熱過(guò)程中的作用，我們首先檢測(cè)了肩胛間區(qū)BAT、iWAT 和eWAT 中PAQR9 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在BAT 中特異性高表達(dá)。與室溫條件相比較，4 ℃冷暴露刺激后，BAT 和iWAT 中PAQR9 表達(dá)顯著上調(diào)，在iWAT 中提取的成熟脂肪細(xì)胞中的結(jié)果與上述一致。由于冷刺激能夠促進(jìn)BAT 產(chǎn)熱，以上結(jié)果提示脂肪產(chǎn)熱過(guò)程中PAQR9 扮演著重要角色。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用兩種不同的細(xì)胞模型進(jìn)行研究，首先將DE2-3 前棕色脂肪細(xì)胞系誘導(dǎo)分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在分化第6 天脂肪細(xì)胞中PAQR9 顯著性高表達(dá)，提示PAQR9 在棕色脂肪細(xì)胞的成脂分化過(guò)程中可能發(fā)揮作用。PPARγ 被認(rèn)為是脂肪早期形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而脂聯(lián)素（adiponectin/Adipoq）和FABP4 則負(fù)責(zé)成熟脂肪細(xì)胞的形成［25］。于是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)以上成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA 水平，結(jié)合油紅O 染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PAQR9 后DE2-3 細(xì)胞的成脂分化能力無(wú)明顯變化。在DE2-3 細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)PAQR9，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)標(biāo)志性產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平顯著上調(diào)。細(xì)胞耗氧量的檢測(cè)是研究細(xì)胞代謝及其功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，液態(tài)氧電極法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PAQR9 上調(diào)可以促進(jìn)氧氣消耗，促進(jìn)細(xì)胞代謝。在DE2-3 細(xì)胞中敲低PAQR9 后，UCP1 的mRNA 水平顯著下調(diào)。

以C3H10T1/2 細(xì)胞為研究模型，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在第4～6 天脂肪細(xì)胞分化成熟時(shí)PAQR9 的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)。敲低PAQR9 之后UCP1 蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)。敲低PAQR9 后脂肪細(xì)胞的成脂分化無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，在C3H10T1/2 細(xì)胞中敲低PAQR9 會(huì)抑制產(chǎn)熱基因UCP1 的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PAQR9 能夠促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱，調(diào)控產(chǎn)熱基因UCP1 的表達(dá)，為PAQR9 在脂肪代謝領(lǐng)域的研究提供了思路，為治療肥胖等疾病提供更多理論依據(jù)，為研發(fā)新型減肥藥帶來(lái)了重大突破。未來(lái)可以進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步研究和探討PAQR9 的作用通路及機(jī)制等問(wèn)題。